Expressão e caracterização da Aqualisina de Myxococcus xanthus

• Ano de defesa: 2017
• Autor(a) principal: Sant'Ana, Aquiles Melchior
• Orientador(a): Puzer, Luciano
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal do ABC
• Programa de Pós-Graduação: Programa de Pós-Graduação em Biossistemas
• Link de acesso: http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=105647&midiaext=74043; http://biblioteca.ufabc.edu.br/index.php?codigo_sophia=105647&midiaext=74043/index.php?codigo_sophia=105647&midiaext=74044

Myxobacterias sao bacterias Gram-negativas com uma peculiaridade no ciclo de vida em comparacao a outros procariotos. Em resposta a periodos de baixa disponibilidade de nutrientes, inicia-se um processo de morfogenese cooperativa que culmina na formacao de corpos de frutificacao, um agregado de celulas que contem estruturas de resistencia caracteristicas. Subtilisinas sao serino proteases da familia S8A, inicialmente encontrada no Bacillus subtilis e atualmente identificada em uma ampla variedade de organismos procarioticos e eucarioticos. Essas enzimas apresentam um grande mercado de aplicacoes biotecnologicas e industriais. O objetivo deste trabalho foi clonar aqualisina, uma subtilisina extracelular da Myxococcus xanthus, uma especie de myxobacterias que preda outros microrganismos, e submete-la a um sistema de expressao heterologa em celulas E. coli BL2 (DE3). A proteina permaneceu na fase insoluvel apos as lises; portanto, foi necessario otimizar protocolos de solubilizacao e purificacao da aqualisina dos corpos de inclusao da celula, para que fosse possivel a caracterizacao cinetica. A solubilizacao utilizando tampao 0,1M de tris e pH 12 mostrou-se a mais eficiente em solubilizar os corpos de inclusao, o que permitiu obter os valores cineticos Km de 0,6 e 1,3 ¿ÊM, para aqualisina purificada (AQN) e para nao retida pela coluna (FT), respectivamente, que demonstram uma alta afinidade pelo substrato utilizado. No entanto, valores obtidos de kcat, e kcat/Km apontam a presenca de duas populacoes de proteinas, nas quais a populacao inativa esta presente em maior quantidade. Embora o sistema de expressao da aqualisina tenha ocorrido com sucesso, a solubilizacao dos corpos de inclusao sem utilizacao de agentes desnaturantes, e posterior purificacao ainda necessitam ser otimizadas, a fim de aumentar a recuperacao de enzima ativa, possibilitando que sua caracterizacao cinetica seja realizada sem a influencia desta populacao de enzima inativa.