Produção e purificação da proteína Cas13a de Leptotrichia wadeii e análise de sua aplicabilidade para detecção de Plasmodium vivax e vírus Zika

• Ano de defesa: 2020
• Autor(a) principal: Mota, Daniele Sousa
• Outros Autores: http://lattes.cnpq.br/6450592239077241, https://orcid.org/0000-0002-7716-3815
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal do Amazonas; Instituto de Ciências Biológicas; Brasil; UFAM; Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
• Palavras-chave em Português: Malária; Plasmodium vivax; Sistema CRISPR-Cas13a; Vírus Zika; Purificação da proteína recombinante; CIENCIAS BIOLÓGICAS; Crispr; Cas13a; Diagnóstico
• Link de acesso: https://tede.ufam.edu.br/handle/tede/7705

As doenças infecciosas continuam sendo um grande problema de saúde no mundo, fazendo parte de maneira significativa dos dados de morbimortalidade. O reconhecimento precoce destas enfermidades, através do uso de testes para diagnóstico rápidos e precisos, agilizam o tratamento do paciente, permitindo assim um melhor atendimento clínico. A malária e a febre do vírus Zika (ZIKV) são doenças infecciosas típicas das regiões tropicais do mundo, como a Amazônia brasileira. As ferramentas tradicionais para identificação dessas doenças possuem desvantagens que limitam a detecção, como baixa especificidade e sensibilidade. Logo, a busca de novos métodos capazes de superar estas dificuldades vem sendo almejada por muitos grupos de pesquisa públicos e privados. Neste campo, o sistema CRISPR-Cas vem ganhando destaque nos últimos 5 anos, contribuindo para importantes avanços no desenvolvimento de técnicas para detecção precisa de alvos moleculares. O objetivo geral deste trabalho foi realizar a expressão e purificação da proteína do sistema CRISPR-Cas13a, chamada LwCas13a, assim como validar sua atividade enzimática aplicando ferramentas para o diagnóstico de malária causada por Plasmodium vivax e para Zika vírus. Como resultados, obtivemos com sucesso a expressão e purificação da proteína recombinante LwCas13a, produção de CRISPR RNA (crRNA) e de RNA alvo sintético (ssRNA) específicos para Plasmodium vivax e ZIKV. Quais observamos reatividade da enzima LwCas31a com uma elevação da intensidade de fluorescência à medida que se aumentava as concentrações de ssRNA no sistema. Uma relação inversamente proporcional foi observada quando dsDNA foi utilizado. As amostras clínicas de pacientes infectados com ZIKV apresentaram reatividade positiva utilizando o método descrito. Não foram obtidos resultados satisfatórios para o diagnóstico de malária por P. vivax utilizando as ferramentas produzidas. Trabalhos futuros serão aplicadas as ferramentas produzidas a um N amostral maior de pacientes infectados por ZIKV e novos alvos moleculares que permitam a detecção eficiente Plasmodium vivax utilizando o sistema CRISPR-Cas13a.