Identificação das espécies do Complexo Burkholderia cepacia em pacientes com fibrose cística: comparação entre as técnicas de Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry e o sequenciamento do gene recA

• Ano de defesa: 2017
• Autor(a) principal: Vianna, Edgard de Freitas
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade do Estado do Rio de Janeiro; Centro Biomédico::Faculdade de Ciências Médicas; BR; UERJ; Programa de Pós-Graduação em Microbiologia
• Palavras-chave em Português: Burkholderia cepacia complex; Cystic fibrosis; Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry; recA sequencing; Matrix Assisted Laser Desorption-Ionization; Fibrose cística; Complexo Burkholderia cepacia; Sequenciamento do gene recA; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::MICROBIOLOGIA
• Link de acesso: http://www.bdtd.uerj.br/handle/1/14450

O Complexo Burkholderia cepacia (CBc) compreende 20 espécies intimamente relacionadas que se destacam como patógenos oportunistas na Fibrose Cística (FC) e estão associadas a um impacto considerável na morbimortalidade desses pacientes. As espécies e subtipos filogenéticos dentro da espécie Burkholderia cenocepacia variam entre si em relação a transmissibilidade e a virulência. Devido a inconsistências na correta identificação das espécies do CBc por métodos fenotípicos, os métodos moleculares são recomendados. Entretanto não existe uma metodologia molecular universal que possa ser aplicada para todos os micro-organismos, especialmente em laboratórios clínicos. Nesse sentido, a metodologia baseada em espectrometria de massa surge como uma alternativa. O objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho do Matrix Associated Laser Desorption-Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) comparado à identificação das espécies do CBc através do sequenciamento do gene recA em pacientes com FC. Foram analisadas 43 amostras obtidas de diferentes espécimes clínicos no período de janeiro de 2014 a fevereiro de 2016. Um total de 18 (41,86%) amostras de Burkholderia vietnamiensis, 14 (32,55%) Burkholderia cenocepacia subtipo IIIB, oito (18,6%) Burkholderia cenocepacia subtipo IIIA, duas (4,65%) Burkholderia contaminans e uma (2,32%) Burkholderia cepacia foram identificadas pelo sequenciamento do gene recA. A identificação pelo MALDI-TOF MS foi avaliada considerando o cultivo prévio em Ágar Sangue de Carneiro (ASC) e Columbia Ágar Base (CAB). 81,39% das amostras provenientes do ASC foram identificadas a nível de gênero (log ≥1.70-1.99) e 41,86% a nível de espécie (log ≥2.00), correspondendo a 11 amostras de B. vietnamiensis (61,11%), quatro de B. cenocepacia IIIB (28,57%) e duas de B. cenocepacia IIIA (25%). Apenas 39,53% das amostras cultivadas em CAB foram identificadas a nível de gênero e 16,27% em espécie: B. vietnamiensis (n=4; 22,22%) e B. cenocepacia IIIB (n=2; 14,28%). A amostra de B. cepacia foi identificada a partir de ambos os meios e as duas amostras de B. contaminans não foram identificadas. O desempenho do MALDI-TOF MS variou com a utilização de diferentes meios de cultura e a identificação a nível de espécie foi inferior a 50% considerando os pontos de corte estabelecidos pelo fabricante. Assim, avaliamos se a redução dos pontos de corte aumentaria a acurácia da identificação. Com a minoração do escore para ≥1.70-1.99 (considerado como identificação confiável a nível de gênero), foram identificadas mais três amostras de B. vietnamiensis, quatro de B. cenocepacia IIIA e sete de B. cenocepacia IIIB, correspondendo a um aumento de 32,55% (em relação ao escore ≥ 2.00). Entretanto o número de amostras analisadas não permite que esse critério seja utilizado sendo necessário estudos adicionais. Apesar da limitação do MALDI-TOF MS como método para tipagem, a utilização de ferramentas de bioinformática para análise dos espectros de massa obtidos no MALDI-TOF MS permitiu o agrupamento de 96% dos subtipos filogenéticos IIIA e IIIB de cepas B. cenocepacia. Observamos também através dos nós formados na árvore filogenética a proximidade das amostras relacionadas ao mesmo paciente, porém a ausência de comparação com um método de tipagem de referência não permite inferir a sua utilização para fins epidemiológicos.