Alterações epigenéticas na morfogênese in vitro: estudo comparativo de padrões de metilação de DNA durante a organogênese e a embriogênese somática em Solanum melongena L. (berinjela)

• Ano de defesa: 2019
• Autor(a) principal: Alencar, Amanda Santos de
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade do Estado do Rio de Janeiro; Centro Biomédico::Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes; BR; UERJ; Programa de Pós-Graduação em Biologia Vegetal
• Palavras-chave em Português: Callogenesis; Simultaneous induction; BAP; MSAP; LFY; Calogênese; Indução simultânea; Berinjela; Genética vegetal; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BOTANICA
• Link de acesso: http://www.bdtd.uerj.br/handle/1/7916

Embora diversos protocolos para a indução de organogênese e embriogênese somática in vitro tenham sido estabelecidos para a berinjela, os mecanismos moleculares que controlam esses processos são pouco compreendidos. Neste trabalho, a técnica MSAP (Methylation Sensitive Amplified Polymorphism) foi aplicada em calos organogênicos e embriogênicos em diferentes estágios de desenvolvimento, a fim de identificar possíveis diferenças epigenéticas entre as duas vias de regeneração. O sistema de cultivo in vitro utilizado caracteriza-se por apresentar o desenvolvimento simultâneo de ambos os tipos de calos em diferentes regiões de explantes cotiledonares em resposta ao mesmo regulador de crescimento. Sementes de berinjela cv. Florida Market foram descontaminadas com hipoclorito de sódio e inoculadas em meio MS½ (concentração de sais pela metade). Após 21 dias, segmentos cotiledonares foram excisados e inoculados em meio sólido MS + BAP 5 mg/L. O DNA foi extraído do explante original e de calos formados após 7, 10 e 14 dias de cultura. Para a análise MSAP, o DNA foi digerido com EcoR I, Msp I e Hpa II, seguido pela ligação de adaptadores, pré-amplificação e amplificação seletiva com 19 combinações de primers. A eletroforese foi realizada em géis de poliacrilamida desnaturante a 6% e corados com nitrato de prata. Entre os 19 primers testados, 15 tiveram um padrão de banda analisável, com um total de 715 bandas. Considerando todos os primers, a metilação total correspondeu a 43,9% dos eventos epigenéticos, seguida de demetilação (26,96%), metilação externa (20,63%) e metilação interna (8,9%). Os dois tipos de calos apresentaram diferentes dinâmicas de taxas de metilação completa ao longo do tempo de cultura. Mudanças nos padrões de bandas ao longo do período de cultivo (0, 7, 10 e 14 dias) e polimorfismos entre os calos organogênicos e embriogênicos foram observadas em 11 primers, e um total de 34 potenciais marcadores epigenéticos associados a cada via de regeneração foram visualizados. A combinação de primers EcoR I + CAG x Msp I - Hpa II + GTCA apresentou 188 fragmentos amplificados, dos quais 22 polimórficos, sendo considerado o melhor desempenho entre os primers testados. A reconstrução da sequência genômica compreendida pelo sítio de corte 5'-CCGG-3' e pelo primer seletivo Msp I-Hpa II + GTCA forma o motif 5'-CGGTCA-3'. Resultados de busca em bancos de dados apontaram que este motif corresponde à parte da sequência de reconhecimento do domínio de ligação ao DNA da proteína LFY (LEAFY) em Arabidopsis thaliana, que está envolvida com a diferenciação e identidade de meristemas florais, atuando como fator de transcrição. Deste modo conclui-se que a técnica de MSAP pode ser utilizada para a detecção de padrões de metilação específicos em calos organogênicos e embriogênicos de berinjela. O MSAP também pode ser aplicado de modo direcionado por meio da construção de primers seletivos com motifs de interesse, possibilitando a inferência da atividade de genes presentes no fragmento compreendido pelo primer.