Estudos de criopreservação, análise fitoquímica e avaliação da estabilidade genética de Cleome spinosa Jacq. (Cleomaceae)

• Ano de defesa: 2019
• Autor(a) principal: Vilardo, Anna Flávia Rodrigues Mortani
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade do Estado do Rio de Janeiro; Centro Biomédico::Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes; Brasil; UERJ; Programa de Pós-Graduação em Biologia Vegetal
• Palavras-chave em Português: Aclimatization; Chromatography; Long-term conservation; D cryo-plate; Medicinal plant; Molecular markers; V cryo-plate; Plantas Medicinais; Tecidos vegetais - Culturas e meios de cultura; Matéria médica vegetal - Propagação in vitro; Aclimatização; Conservação em longo prazo; Cromatografia; D-Crioplaca; Marcadores moleculares; Planta medicinal; V-Crioplaca; OUTROS
• Link de acesso: http://www.bdtd.uerj.br/handle/1/18433

Sistemas de conservação de germoplasma baseados na cultura de tecidos vegetais estão sujeitos a contaminações e perdas do seu potencial morfogenético. Estes problemas podem ser evitados pelo estabelecimento da criopreservação, método que permite a conservação em longo prazo de material biológico por meio da imersão em nitrogênio líquido. O presente trabalho teve por objetivos a criopreservação de ápices caulinares obtidos de plantas produzidas in vitro de Cleome spinosa, empregando as técnicas de vitrificação e dessecação com uso de crioplacas (V-Crioplaca e D-Crioplaca, respectivamente), além da avaliação da estabilidade genética e fitoquímica do material criopreservado. Para a técnica de V-Crioplaca, foi avaliada a etapa de recuperação, com o emprego de diferentes concentrações e períodos de cultivo na presença do regulador de crescimento benzilaminopurina (BAP). Os ápices foram submetidos a tratamento com a solução PVS2 (25°C ou 0°C), empregando protocolos previamente estabelecidos para a espécie. No presente estudo, os maiores percentuais de sobrevivência (83%) e recuperação (76%) foram obtidos utilizando ápices caulinares pré-cultivados em meio MS com concentrações crescentes de sacarose (0,25 M - 0,5 M), expostos à PVS2 por 90 minutos (0°C) e submetidos à etapa de recuperação em meio contendo 0,5 mg.L-1 de BAP por 15 dias. Para a técnica de D-Crioplaca, empregada pela primeira vez para a espécie, foram avaliados o efeito do pré-cultivo, alteração na concentração de sacarose na solução de polimerização, tratamento com solução de loading, exposição à sílica gel e tempo de cultivo em presença de BAP durante a recuperação dos ápices caulinares. Os resultados obtidos mostraram que o tratamento mais eficiente consistiu no pré-cultivo em concentrações crescentes de sacarose (0,25 M - 0,5 M) por 48h, fixação às crioplacas com auxílio de solução de polimerização contendo 0,6 M de sacarose, seguido de exposição ao loading (20 min) e dessecação em sílica gel por 60 min. A etapa de recuperação ocorreu em meio MS acrescido de 0,5 mg.L-1 de BAP por 15 dias, com posterior transferência do material para meio MS0. Este protocolo resultou nas maiores porcentagens de sobrevivência (76%) e recuperação (70%), após a criopreservação por D-Crioplaca. A aclimatização e as análises molecular e fitoquímica, foram realizadas com plantas regeneradas após a criopreservação empregando a técnica de V-Crioplaca. As plantas desenvolvidas a partir de ápices criopreservados, alcançaram uma taxa de aclimatização de 100%, e apresentaram aspecto fenotípico normal. A análise da estabilidade genética visou comparar as plantas regeneradas após o processo de criopreservação (-NL e +NL) com suas respectivas plantas matrizes, empregando as técnicas de marcadores moleculares SCoT e ISSR. As análises SCoT revelaram um baixo grau de polimorfismo, sendo encontrado apenas um único fragmento polimórfico, enquanto que pela técnica ISSR não foram encontrados polimorfismos para os fragmentos analisados. Extratos metanólicos de plantas regeneradas após a criopreservação (+NL), plantas propagadas in vitro e plantas coletadas a campo foram submetidos a análise por cromatografia líquida de alta eficiência visando a comparação de seu perfil fitoquímico. Os resultados demonstraram que a amostra de campo apresentou uma maior diversidade de substâncias, enquanto as plantas propagadas in vitro mostraram perfis cromatográficos similares. Os estudos realizados com C. spinosa demonstraram a viabilidade do uso das técnicas de criopreservação para a conservação em longo prazo de materiais biotecnológicos estabelecidos com a espécie.