Produção de anticorpos policlonais para a pesquisa de produção de toxina diftérica por cepas de Corynebacterium diphtheriae
| Ano de defesa: | 2016 |
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| Autor(a) principal: | |
| Orientador(a): | |
| Banca de defesa: | |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Tipo de acesso: | Acesso aberto |
| Idioma: | por |
| Instituição de defesa: |
Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Centro Biomédico::Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes Brasil UERJ Programa de Pós-Graduação em Saúde, Medicina Laboratorial e Tecnologia Forense |
| Programa de Pós-Graduação: |
Não Informado pela instituição
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| Departamento: |
Não Informado pela instituição
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| País: |
Não Informado pela instituição
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| Palavras-chave em Português: | |
| Link de acesso: | http://www.bdtd.uerj.br/handle/1/19965 |
Resumo: | Apesar do sucesso dos protocolos de imunização em massa contra a difteria em diversos países, incluindo no Brasil, essa enfermidade ainda continua sendo uma doença com potencial infeccioso reemergente e de alta morbidade e mortalidade, que requer a utilização de antitoxina diftérica (produzida em cavalos) para o tratamento e diagnóstico da produção de toxina. Nesta investigação, anticorpos antitoxina diftérica foram produzidos em coelhos e, após o fracionamento, a preparação de imunoglobulinas foram testados em paralelo à antitoxina produzida em cavalos (SAD comercial). Coelhos (n=2) foram imunizados com toxina diftérica dimerizada (desprovida de atividade tóxica). A imunização experimental nos coelhos foi realizada com o consentimento do comitê de experimentação animal da UERJ (CEUA/033/2015). As cepas clínicas e de referência foram testadas para a confirmação das espécies e produção de toxina pelo PCR multiplex. A reatividade contra a toxina produzida pelas cepas foi realizada pelos métodos fenotípicos usuais (imunodifusão radial simples e teste de Elek modificado). A capacidade de neutralização de toxina foi avaliada através do teste de citotoxicidade para células VERO. A detecção de toxina na superfície de amostra produtora de toxina (ATCC 27012) e não produtora de toxina (ATCC 27010) foi avaliada após a biotinilação da fração de Igs e por revelação com estreptavidina conjugada à fluoresceína. A antitoxina de cavalo (SAD) apresentou diversas linhas de precipitação que poderiam gerar confusão quando da leitura do ensaio, através do teste de Elek modificado e diversas cepas não toxinogênicas apresentaram resultados positivos através do ensaio de imunodifusão radial (IDR). Uma discordância de 80% foi observada nos resultados de IDR entre as amostras tox–, e de 40% através dos testes de Elek quando o SAD comercial foi utilizado. Os resultados utilizando a fração de imunoglobulinas de coelho apresentaram resultados variáveis apenas para uma cepa tox– (HC03). De modo geral, uma concordância de 90% foi obtida nos ensaios de Elek modificado utilizando anticorpos de coelho. A fração de anticorpos de coelho foi capaz de neutralizar a toxina na diluição 1:1200, quando comparado com 0.1 UI de SAD. O soro pré-imune de ambos os coelhos foram incapazes de neutralizar a toxina ou reagir através do teste de Elek. Os anticorpos biotinilados foram capazes de ligar à cepa tox+ ATCC 27012 através do método de fluorescência. O antissoro de coelho comportou-se como um reagente com maior precisão para a identificação das cepas tox+ de C. diphtheriae, com um bom título neutralizante. Os anticorpos biotinilados podem ser utilizados como métodos diagnósticos da toxinogenicidade de amostras de C. diphtheriae |