Detalhes bibliográficos
| Ano de defesa: |
2019 |
| Autor(a) principal: |
Joaquim, Elisandra Aurélia Duarte
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| Orientador(a): |
Silveira, Rafael Bertoni da
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| Banca de defesa: |
Eger, Iriane
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Ferreira, Marianna Boia
,
Kanunfre, Carla Cristine
,
Rodrigues, Silvia Daniele
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| Tipo de documento: |
Dissertação
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| Tipo de acesso: |
Acesso aberto |
| Idioma: |
por |
| Instituição de defesa: |
Universidade Estadual de Ponta Grossa
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| Programa de Pós-Graduação: |
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biomédicas
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| Departamento: |
Setor de Ciências Biológicas e da Saúde
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| País: |
Brasil
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| Palavras-chave em Português: |
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| Área do conhecimento CNPq: |
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| Link de acesso: |
http://tede2.uepg.br/jspui/handle/prefix/3134
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Resumo: |
O veneno da vespa social Polybia paulista, geralmente formado de uma complexa mistura de componentes, mostra ser uma grande área de estudo para descoberta de novas biomoléculas. Os inibidores de proteases são proteínas ou peptídeos amplamente distribuídos na natureza; são moléculas que têm a capacidade de inibir a ação de enzimas proteolíticas formando complexos estáveis com proteases-alvo. Investigar as propriedades biológicas e farmacológicas de inibidores de proteases é fundamental para compreender seus mecanismos em processos patofisiológicos, além da potencial utilização para fins econômicos e terapêuticos. O objetivo do trabalho foi a identificação e caracterização de inibidores de protease no extrato de glândula do veneno da vespa. Para isso, primeiro foi extraído as proteínas do veneno por dissecção manual e armazenados em PBS. Após foi identificado a presença do inibidor de protease por zimografia reversa copolimerizada com gelatina, incubado com tripsina. Na sequência, houve a caracterização do inibidor de protease por zimografia reversa, utilizando diferentes substrato em conjunto com a incubação de diferentes enzimas proteolíticas: tripsina, papaína, α-quimotripsina, proteinase k e pepsina .Após esse processo, foi realizado o enriquecimento dos componentes proteicos do extrato do veneno de Polybia paulista através de cromatografia por exclusão molecular utilizando coluna Yara Phenomenex Sec. 2000. Com isso foi possível rastrear as eluições para encontrar o inibidor de protease das frações cromatográficas, utilizando-se SDS-PAGE gradiente (20 a 5%) corado com coloração de prata monocromática e zimografia reversa em diferentes tempos de incubação corados com Comassie blue R-250. Identificou-se a presença de inibidor de protease sobre a tripsina nos dois ninhos utilizados para esse trabalho, ambos com migração eletroforética próximo a 150kDa. Foi investigada a possível interação do agente redutor β-mercaptoetanol com a temperatura, observou-se perda de atividade inibitória a 100°C.e a não-interação do agente redutor com o inibidor presente no extrato. Na caracterização com as enzimas e substratos, visualizou-se com o substrato gelatina um inibidor com 150 kDa que inibiu as enzimas tripsina, α-quimotripsina e proteinase K, todas pertencentes a classe das serino-proteases. No substrato caseína foi encontrado um inibidor com 100 kDa e com os substratos ovoalbumina e BSA um inibidor de 60kDa. Com a enzima papaína da classe dos inibidores de cisteíno-protease apresentou a mesma migração eletroforética que foi encontrada em todas as outras enzimas em seus respectivos substratos. Foi possível avaliar o pH ótimo de atividade inibitória com a enzima pepsina que requer um pH 2,0 para a sua atividade, demostrando que os inibidores são influenciados pelo pH. A cromatografia por exclusão molecular permitiu uma separação das moléculas, mas não o isolamento do inibidor. Considerando os resultados obtidos, os inibidores de protease presentes no extrato de glândula de veneno de P. paulista colaboram com outros pesquisadores que mostram a presença de inibidores de serino-cisteíno protease no veneno, são ainda poucos compreendidos em suas funções que precisariam ser respondidas e elucidadas. |
