Avaliação e validação de proteínas recombinantes do Treponema pallidum para o imunodiagnóstico da sífilis

• Ano de defesa: 2020
• Autor(a) principal: Silva, Ângelo Antonio Oliveira
• Orientador(a): Santos, Fred Luciano Neves
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Link de acesso: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/50558

INTRODUÇÃO: A sífilis é uma infecção sexualmente transmissível (IST) causada pela bactéria Treponema pallidum, que se caracteriza por ser crônica, multissistêmica e restrita aos seres humanos. É um problema de saúde pública, considerada como a mais importante infecção que afeta gestantes e recém-nascidos. O diagnóstico laboratorial é realizado com testes sorológicos não-treponêmicos (VDRL e RPR) e testes treponêmicos (ELISA, QML e IFI). Dentre os treponêmicos, os imunoenzimáticos apresentam bom desempenho, a depender da preparação antigênica utilizada. Desta forma, proteínas recombinantes fornecem maior confiabilidade aos resultados por melhorarem a sensibilidade, especificidade e a reprodutibilidade dos imunoensaios. OBJETIVO: Avaliar o potencial diagnóstico das proteínas recombinantes TpN17, TpN47, TpN15 e TmpA do T. pallidum para o diagnóstico laboratorial da sífilis. MATERIAL E MÉTODOS: As proteínas foram produzidas e purificadas no Instituto de Biologia Molecular do Paraná. Os ensaios de ELISA indireto foram padronizados e otimizados através de checkerboard titration para determinar a quantidade ideal de antígeno, anticorpo secundário e amostras séricas, utilizando 4 pools negativos e 3 pools positivos em duplicata. Para o estudo de fase I, 653 amostras séricas foram consideradas elegíveis, sendo 143 positivas para sífilis, 301 negativas e 209 positivas para outras doenças infecto-parasitárias. As amostras foram reavaliadas para a presença ou ausência de anticorpos para sífilis, com testes não-treponêmicos (USR e RPR) e/ou treponêmicos (FTA-ABS - IIFT IgG). RESULTADOS: Na padronização, a maior diferença do sinal entre as amostras positivas e negativas foi atingida utilizando as seguintes condições: TpN17 e TpN47 (100 ng do antígeno, 1:25 do soro e 1:20.000 do conjugado) e TmpA (200 ng do antígeno, 1:25 do soro e 1:10.000 do conjugado). Não foi possível padronizar a molécula TpN15, provavelmente devido a problemas de expressão e purificação, e por isto ela foi desconsiderada do estudo. No estudo de fase I, TpN17, TmpA e TpN47 obtiveram área abaixo da curva (AUC) de 97,2%, 91,8% e 81,6%, respectivamente. A TpN17 e TmpA apresentaram especificidade de 100% enquanto a TpN47 obteve 99,7%. Todavia, do quantitativo de amostras positivas, a TpN17 e a TmpA diagnosticaram 43 amostras como falso-negativas, resultando em sensibilidade de 69,9%. Já a TpN47, diagnosticou 66 amostras como falso-negativas, apresentando sensibilidade de 53,8%. Na determinação do índice de reatividade cruzada, foi observada reatividade de 2,9% (6/209) para a TpN17 (leptospirose: 6) e 16,74% (35/209) tanto para a TmpA (leptospirose: 32; dengue: 1; filariose: 1; esquistossomose: 1) quanto para a TpN47 (leptospirose: 32; filariose: 1; HIV: 2). No ensaio de reprodutibilidade intra-placa não houve diferença significativa entre as moléculas, apresentando assim uma boa repetitividade dos ensaios. CONCLUSÃO: A despeito dos baixos valores de sensibilidade reportados, as proteínas mostraram elevada capacidade diagnóstica em virtude dos valores de AUC encontrados. Contudo, uma melhora na sensibilidade pode ser alcançada quando misturas antigênicas forem avaliadas, consistindo na próxima etapa de nossa investigação.