Impacto funcional de pequenas mutações em Mycobacterium bovis BCG Moreau em comparação com Mycobacterium tuberculosis cepa H37Rv

• Ano de defesa: 2019
• Autor(a) principal: Schwarz, Marcos Gustavo Araujo
• Orientador(a): Lima, Leila de Mendonça
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Link de acesso: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/37283

A tuberculose continua sendo uma doença relevante no que diz respeito à saúde mundial. A doença é causada pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis e a única medida profilática disponível é a vacinação com BCG, uma cepa atenuada derivada de M. bovis. BCG é uma família de diferentes cepas que possuem diferenças genéticas entre si. Pequenas mutações em sequências codificantes podem causar impactos funcionais relevantes, modificando drasticamente a função/estrutura da proteína ou até alterando o nível de expressão, devido à modificação de processos de transcrição/tradução. Para melhor compreender o impacto dessa categoria de mutação na biologia do BCG, identificamos e selecionamos casos de mutação em três loci preditos de estarem envolvidos em processos biológicos importantes para micobactérias, como metabolismo redox (dodecina \2013 rv1498A), metabolismo lipídico (homólogo de rv1371/2/3) e respiração anaeróbica (fumarato redutase). Essas mutações foram identificadas pela análise de genômica comparativa entre M. tuberculosis H37Rv e M. bovis BCG Moreau. Análises de RT-PCR e western blotting mostram que a transcrição e tradução desses genes não foram afetadas pelas mutações. Modelagem estrutural das proteínas mutadas indica um drástico impacto na atividade de dodecina, corroborado por nossos ensaios funcionais, diferentemente do complexo da fumarato redutase. Mutantes knockout foram criados e resultados preliminares mostram que o operon da fumarato redutase é funcional em BCG Moreau, já que o mutante \F044frd possui um fenótipo diferencial no crescimento quando comparado com a cepa selvagem Já para \F044rv1371/2/3 não foi observado tal padrão. Complementação da cepa selvagem com alelos de rv1371/2/3 de M. tuberculosis e BCG corrobora a hipótese de não-funcionalidade da cópia de BCG, já que identificamos lipídeos diferentes quando ambas as cepas foram comparadas. Não foi viável a inativação do gene codificante para dodecina, nem a construção da cepa de knockdown condicional, que seria utilizada para analisar a essencialidade desse gene. Complementação de M. smegmatis com os alelos de rv1498A de M. tuberculosis e BCG mostram que ambas as cópias resultaram em maior crescimento das cepas em meio axênico, em uma magnitude similar para ambos os alelos em comparação com a cepa selvagem. Análises proteômicas revelam que diversos genes com pequenas mutações que possuem diferenças em seu nível de expressão quando comparadas as diferentes fases de crescimento estão envolvidos em metabolismo lipídico, revelando a importância de se investigar tal característica. Nossos resultados mostram que algumas mutações preditas podem não causar o impacto funcional esperado, provavelmente porque forças seletivas podem estar atuando sob esses loci.