Proteína M recombinante do Histoplasma capsulatum: Mapeamento de epítopos e aplicação no diagnóstico da histoplasmose

• Ano de defesa: 2006
• Autor(a) principal: Guimarães, Allan Jefferson
• Orientador(a): Oliveira, Rosely Maria Zancopé, Peralta, José Mauro
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Link de acesso: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/5661

A histoplasmose é causada pelo fungo dimórfico Histoplasma capsulatum. A infecção por este organismo é freqüentemente diagnosticada pela determinação da presence de anticorpos para a proteína M, imunodominante, mas o papel deste antígeno na patogênese da histoplasmose permanence obscuro. A função do antígeno M não é conhecida, mas geneticamente esta proteína é homologa catalases fúngicas. Em nosso estudo, nós procuramos determinar regiões imunodominantes do antígeno M, produzir um painel de anticorpos monoclonais contra esta proteína, caracterizá-los, usá-los para o mapeamento de epítopos, mostrar a localização do antígeno M na levedura do H. capsulatum, demonstrar a atividade de catalase desta proteína e desenvolver imunoensaios para a detecção de anticorpos contra esta proteína e entígeno M circulante nos fluidos corporais. Foi possível determinar peptídeos com maior atividade antigênica e suas localizações na molécula e caracterizá-los de acordo com as suas propriedades bioquímicas. Nós geramos três fragmentos que continham estes peptídeos e os utilizamos para avaliar a ligação dos anticorpos monoclonais e reconhecimento a cada fragmento separadamente. Um dos fragmentos, F3, mostrou maior ligação aos anticorpos monoclonais que os outros avaliados, entretanto estudos adicionais devem ser avaliados para um complete mapeamento. Para avaliar o papel do antígeno M na patogênese da histoplasmose, usando análise por imunoblot de um extrato de parede celular e membrana (CW/M) obtido de levedura, provamos que os mAbs gerados contra o antígeno M recombinante puderam reconhecer este antígeno no extrato utilizado. Estudos de imunofluorescencia também revelaram que os mAbs reconheciam proteínas na superfície da levedura. Adicionalmente, avaliamos a atividade de catalase usando diferentes frações celulares para sugerir a localização da enzima e confirmamos que a maior atividade de catalase estava presente nos extratos incluindo antígenos de superfície. A capacidade do antígeno M em funcionar como catalase sugere que esta enzima está provavelmente envolvida na proteção pelas leveduras contra o stress oxidativo na interior do fagolisossomo e escape dos mecanismos fungicidas nos macrófagos. A localização do antígeno M na superfície do Hc tem importantes implicações na antigenicidade da proteína já que está acessível ao sistema imunológico do hospedeiro e interações com os anticorpos. Adicionalmente, a ELISA para a detecção de anticorpos utilizando histoplasmina purificada e tratada (ptHMIN) mostrou uma sensibilidade de 92% e uma especificidade de 96%, enquanto a ELISA para a detecção de antígenos mostrou uma sensibilidade de 80% e uma especificidade de 91%, provando que estas duas metodologias poderiam ser utilizadas no diagnóstico da histoplasmose.