Detalhes bibliográficos
| Ano de defesa: |
2021 |
| Autor(a) principal: |
Bassai, Letícia Werzel |
| Orientador(a): |
Shigunov, Patrícia |
| Banca de defesa: |
Não Informado pela instituição |
| Tipo de documento: |
Dissertação
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| Tipo de acesso: |
Acesso aberto |
| Idioma: |
por |
| Instituição de defesa: |
Não Informado pela instituição
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| Programa de Pós-Graduação: |
Não Informado pela instituição
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| Departamento: |
Não Informado pela instituição
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| País: |
Não Informado pela instituição
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| Link de acesso: |
https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/50686
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Resumo: |
A fibrose cística (FC) é uma doença genética, autossômica recessiva causada por mutações no gene CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). A proteína CFTR está presente na membrana apical de células epiteliais e funciona como um canal de íons cloro e bicarbonato mantendo o equilíbrio de água no meio extracelular. Existem mais de 2000 mutações descritas para FC, sendo a mutação F508del a mais comum, com cerca de 70% de prevalência mundial. Atualmente, a doença não tem cura, sendo tratados os principais sintomas, isso faz com que a expectativa de vida seja, em média, 40 anos. Na tentativa de se desenvolver novas abordagens terapêuticas, a técnica de CRISPR/Cas9 se apresenta muito promissora, pois possibilita o reconhecimento e clivagem de uma sequência específica de DNA, ativando pela própria célula o mecanismo de reparo de dano no DNA, que na presença de um DNA com a sequência correta, pode corrigir a mutação. O objetivo deste trabalho é construir ferramentas moleculares para corrigir a mutação F508del de fibrose cística em linhagem celular de epitélio pulmonar (CFBE). O trabalho é dividido em três etapas principais: (1) Construção de ferramentas; (2) Melhora do reparo dirigido por homologia e (3) avaliação da edição. Na primeira etapa foram selecionados desenhos de sgRNA específicos, com softwares de predição, para a mutação F508del do gene CFTR. Os desenhos foram selecionados com base na proximidade da mutação, quantidade e localização de off-targets e eficiência predita in silico. Em sequência, foram construídas as ferramentas moleculares sendo uma baseada no plasmídeo (px458) que contém as sequências do sgRNA, da proteína SpCas9 e do gene RFP. A inserção da sequência do sgRNA no plasmídeo foi confirmada pela técnica de PCR, digestão com enzimas de restrição e sequenciamento. O método de transfecção selecionado foi por agentes lipídicos, apresentando eficiência de cerca 9% na entrada do plasmídeo na célula alvo. A ferramenta construída, ribonucleoproteína, teve o RNA obtido por transcrição in vitro e purificado. Após a formação do complexo com a proteína purificada (SaCas9) esta ferramenta mostrou atividade (30%) em reconhecer e clivar o DNA in vitro. A segunda etapa consistiu em tentar melhorar o reparo dirigido por homologia através da sincronização do ciclo celular, para isto foi selecionada a droga hidroxiureia na concentração de 46,80\03BCg/mL que em 24 horas apresentou sincronização das células (60% na fase G2), porém não foi possível realizar o sorting. A terceira etapa consistiu em testar as ferramentas e avaliar a correção por PCR, qPCR e sequenciamento. Aplicando a metodologia descrita após 48 horas de transfecção das células, foi feita uma triagem por citometria de fluxo e a correção confirmada por técnicas de qPCR, a detecção da correção da mutação F508del foi inferior a 12,5% ou nula, nas condições testadas. Novos ensaios serão realizados com modificação do projeto. |
