Estudo da quantificação de soja geneticamente modificada em alimentos pela técnica da reação em cadeia pela polimerase em tempo real: desenvolvimento de método evento específico

• Ano de defesa: 2010
• Autor(a) principal: Branquinho, Maria Regina
• Orientador(a): Leite, Paola Cardarelli
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Link de acesso: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/36176

A técnica de PCR em Tempo Real é uma poderosa ferramenta de quantificação de OGM em alimentos, mas ainda é muito influenciada por fatores como amostragem, eficiência da extração do DNA, presença de substâncias inibidoras da reação de PCR, pelo nível de degradação do DNA e pelo próprio genoma vegetal. Atualmente, a quantificação de soja GM está relativamente limitada ao uso de kits sendo um dos mais utilizados, o que tem como sequência alvo o promotor p35S. A quantificação de soja RR em matrizes complexas que possam conter esse elemento genético oriundo de outros vegetais pode resultar em falso positivos ou em níveis superestimados de OGM. O desenvolvimento de métodos evento específicos visa à quantificação dessas matrizes com maior confiabilidade. Este trabalho teve como objetivos principais o desenvolvimento de um método evento específico que tem com alvo a região de integração do p35S e o genoma da soja; a avaliação de alguns indicadores de desempenho e quantificação de duas matrizes com o método desenvolvido; a avaliação do desempenho do kit “TaqMan GMO 35S Soy Detection” que tem como alvo o p35S, utilizado na rotina; a determinação do conteúdo de OGM em alimentos processsados pelo kit; e a avaliação do efeito de dois protocolos de extração de DNA na reação de PCR em tempo real. Os resultados mostraram que tanto o método de extração pelo CTAB como o kit DNeasy® (Qiagen) foram eficientes na extração de DNA das amostras de diferentes graus de processamento e que as análises comparativas das curvas analíticas da amplificação da lectina e do p35S não revelaram influência significativa dos métodos de extração na eficiência da PCR em tempo real. Os parâmetros de desempenho do kit de quantificação demonstraram linearidade, eficiência e sensibilidade e LOD em torno de 0,0125% e LOQ de 0,05%. A quantificação dos alimentos evidenciou a presença de soja RR com teores menores que 1% em 63,2% e teores maiores que 1% em 36,8% das amostras. O método evento específico desenvolvido para quantificação da soja RR apresentou linearidade, eficiência da PCR entre 86% e 109%, precisão na quantificação do número de cópias do MRC entre 3,6% e 12,7% e as medidas dos Cts foram altamente reprodutíveis. Os resultados da quantificação do teor de OGM nas amostras de biscoito, mistura de farinhas e no MRC 0,5%, utilizando os pares de iniciadores e sondas desenhados, demonstraram exatidão do método desenvolvido, indicando que devem prosseguir os estudos com outras matrizes com diferentes teores de soja RR para posterior validação. Este método vai possibilitar a quantificação diferenciada entre a soja RR e os dois eventos de soja tolerantes ao herbicida glifosinato de amônio, aprovados recentemente no Brasil, uma vez que o método utilizado no INCQS está baseado na amplificação do p35S que é utilizado na construção desses três eventos.