Detecção de Mycoplasma sp. e Acholeplasma laidlawii em imunobiológicos e insumos de processos por PCR em tempo real

• Ano de defesa: 2015
• Autor(a) principal: Gonçalves, Natália Pedra
• Orientador(a): Guedes Júnior, Daniel da Silva, Silvério, Jaline Coutinho
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Link de acesso: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/25076

O gênero Mycoplasma é composto pelos menores procariotos desprovidos de parede celular. Eles estão amplamente distribuídos no ambiente como parasitas humanos, causando pneumonia e doenças urogenitais, ou infectando outros organismos. Além disso, eles frequentemente são encontrados no ambiente industrial contaminando produtos derivados de células biológicas farmacêuticos. A detecção de Mycoplasma sp. e Acholeplasma laidlawii nos produtos biológicos é um teste de controle de qualidade exigido pela Farmacopeia Europeia (FE) e Brasileira realizado rotineitamente indústrias.Foi proposto o desenvolvimento de um protocolo de qPCR in house para a detecção das espécies de Mycoplasma sp. e A. laidlawii preconizados pela FE, visando a melhoria da técnica atual utilizada na SETBI aplicada a produtos biológicos e meios de cultura de Bio-Manguinhos.As sequências gênicas do locus 16S rDNA das oito espécies de Mycoplasma recomendadas pela FE foram obtidas no GenBank® e alinhadas pela ferramenta online ClustalOmega para a seleção das regiões em comum, excluindo-se aquelas encontradas nos gêneros Streptococcus, Clostridium e Lactobacillus, pois são espécies filogeneticamente próximas a Mycoplasma sp. e A. laidlawii. A avaliação dos parâmetros necessários para o desenho dos oligonucleotídeos utilizou o programa online IDT OligoAnalyzer® 3.1 e as reações de qPCR foram realizadas utilizando SYBR® Green e os iniciadores nas concentrações estabelecidas nos ensaios de otimização. A especificidade dos iniciadores foi avaliada in silico - BLASTn® (NCBI©) - e in vitro utilizando DNA extraído de cultura pura de S. pyogenes, C. sporogenes e L. acidophilus, e de cinco espécies de Mycoplasma sp. como controle positivo O limite de deteção (LD) foi estabelecido a partir de curvas-padrão com oito quantidades de cópias de DNA com diluição de fator 10. O desempenho da qPCR in house na deteção de Mycoplasma sp. e A. laidlawii foi comparada com a PCR e o kit comercial MycoSEQ® (Life Technologies©). A avaliação da interferência das matrizes de imunobiológicos e soro fetal bovino na reação de qPCR in house foi avaliada utilizando diferentes frações das amostras e dois kits de extração. Foi desenvolvido um protocolo de qPCR in house através da prospecção de quatro conjuntos de iniciadores específicos capazes de detectar cerca de 40 espécies de Mycoplasma sp., incluindo aquelas preconizadas pela FE, com LD de 1 cópia de DNA para A. laidlawii e 10 cópias para as demais espécies. A qPCR in house demonstrou melhor desempenho na detecção de Mycoplasma sp. e A. laidlawii quando comparada a PCR convencional multiplex utilizada na SETBI e ao kit comercial MycoSEQ® (Life Technologies©). As matrizes de suspensão viral, PAG de vacina de febre amarela apresentam interferência na detecção de Mycoplasma sp. e A. laidlawii reação de qPCR in house, sendo os melhores resultados obtidos quando utilizadas as matrizes totais de ambos os produtos. O ensaio prelimiar com soro fetal bovino demonstrou a necessidade futura de otimização do processo de extração e/ou de amplificação no intuito de eliminar a interferência desta matriz nas reações de qPCR. O desenvolvimento da metodologia de qPCR in house, que demonstrou ser específica e mais sensível do que o atual método aplicado na rotina da SETBI e o kit comercial MycoSEQ® (Life Technologies©), representa a melhoria dos ensaios de controle de qualidade e a diminuição dos custos para Bio-Manguinhos.