Produção e caracterização funcional de proteínas multiepitopos e uso como insumos biotecnológicos - hepatite B e rubéola
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Streszczenie: | Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2011. |
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| spelling | Souza, Marilen Queiroz deTorres, Fernando Araripe Gonçalvesmailto:marilen.souza@gmail.comFelipe, Maria Sueli Soares2019-12-10T17:52:12Z2019-12-10T17:52:12Z2019-12-102011-04-30SOUZA, Marilen Queiroz de. Produção e caracterização funcional de proteínas multiepitopos e uso como insumos biotecnológicos - hepatite B e rubéola. 2011. 146 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2011.https://repositorio.unb.br/handle/10482/35926Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2011.A Hepatite B é uma inflamação hepática causada pelo vírus HBV. O primeiro anticorpo a ser detectado após a infecção é o anti-HBc-IgM. A presença deste anticorpo possibilita a distinção da infecção atual de uma infecção passada ou remota pelo HBV, pois, após a infecção, o anti-HBc-lgM torna-se indetectável. O anti-HBc-lgG aparece logo após o IgM, alcançando rapidamente títulos elevados na hepatite aguda e permanecendo mesmo após a cura. Por ser o primeiro anticorpo presente, e algumas vezes o único marcador detectado durante a evolução da infecção, o anti-HBc pode ser usado tanto para indicar infecção aguda pelo HBV (anti-HBc-IgM) quanto para identificar indivíduos que entraram em contado com o vírus (anti-HBc-IgG). A rubéola é uma infecção causada pelo vírus RV. Geralmente, é uma doença viral leve causada na infância. A doença é de importância para a saúde pública, devido à infecção adquirida na gravidez precoce, que muitas vezes resulta em anomalias fetais, classificados como síndrome da rubéola congênita (SRC). Portanto, um diagnóstico preciso para a diferenciação da rubéola entre outras doenças infecciosas existentes com as mesmas características é imperativo para o tratamento adequado. O objetivo deste projeto é a construção de proteínas antigênicas multiepitopos recombinantes dos vírus HBV e RV, causadores de hepatite B e rubéola respectivamente, que sejam eficazes no reconhecimento de marcadores moleculares de forma que possam ser utilizados como insumos em kits de diagnóstico de hepatite B e rubéola e na produção de anticorpos monoclonais e potencial utilização para fins de pesquisa e desenvolvimento de vacinas, fármacos e medicamentos. Para o desenho da seqüência do gene MEHB (609 pb) foi feita uma busca na literatura para a seleção dos epitopos mais comuns e conservados do vírus HBV. Utilizando a mesma estratégia e com a finalidade de desenvolver uma proteína recombinante multiepitopo, denominada rMERUB, para o diagnóstico de rubéola, seqüências conservadas e imunodominantes de epitopos da região do envelope viral foram unidas. Os genes sintéticos foram clonados, com sucesso, no vetor de expressão pET21a na forma de um inserto Nde I-Xho I contendo uma sequência codificadora para uma cauda his6x tag no C-terminal. Os plasmídeos resultantes foram transformados em Escherichia coli BL21 (λDE3) pLysS. Clones selecionados foram cultivados para a indução das proteínas recombinantes, na presença de IPTG. As análises em gel SDS-PAGE mostraram bandas de indução compatíveis com o tamanho previsto da proteína multiepitopo. Foi realizado Western blot utilizando anticorpo anti-polyHistidine ainda a confirmar a identidade das bandas de indução. A purificação das proteínas foi realizada por uma única etapa por cromatografia de afinidade Ni-NTA. Foram realizados testes para comprovar a atividade imunológica das proteínas, através de ELISA foram comprovadas as reações das proteínas recombinantes com os anticorpos específicos para os respectivos vírus (HBV e RV). Este trabalho encontra-se em fase de ajustes dos testes ELISA para utilização destas proteínas na detecção dos anticorpos virais em soros de pacientes infectados, o que será feito pela empresa WAMA diagnóstica (projeto em parceria).Hepatitis B is a liver inflammation caused by HBV virus. The first antibody detected after exposure to this virus is the anti-HBc IgM. The presence of this antibody enables the identification of the clinical stage of the disease and becomes undetectable after the acute phase. Anti-HBc IgG appears quickly after IgM, reaching high titers in chronic hepatitis and remains even after cure. Since anti-HBc is the first antibody identified and sometimes the only marker detected during the course of infection, it can be used both to indicate HBV acute infection (anti-HBc-IgM), and to identify individuals who have come in contact with the virus (anti-HBc-IgG). Rubella is an infection caused by RV virus. Generally, is a mild childhood viral disease. The disease is of public health importance because infection acquired early pregnancy often results in fetal abnormalities, classified as congenital rubella syndrome (CRS). Therefore, accurate diagnosis for differentiation of Rubella among others infection diseases with the same features is imperative for proper treatment. The goal of this work was to produce recombinant multiepitope antigenic proteins of HBV and RV, which are effective at recognizing molecular markers for diagnosis of hepatitis B and rubella. They can be used in production of monoclonal antibodies and possible use for researching and developing vaccines, drugs and medicines and diagnostic kits for hepatitis B and rubella. For this purpose, a gene sequence named rMEHB was designed taking into account the most common and conserved HBV epitopes. Using the same strategy, with the purpose to develop a recombinant multiepitope protein, called rMERUB, for rubella diagnostic purposes, sequences conserved and immunodominant of epitopes from viral envelope have been joined together. The synthetics genes were cloned into vector pET21a with a NdeI/XhoI fragment and containing a sequence coding for a 6xHis tag at the C terminal. The resulting plasmids were transformed into Escherichia coli BL21 (λDE3) pLysS. Selected clones were grown for induction of the recombinants proteins in the presence of IPTG. SDS-PAGE analysis showed induction bands, which were consistent with the predicted sizes of the multiepitopes proteins. Western blot using anti-polyHis antibody was further performed to confirm the identity of induced protein. The purification of the proteins was performed by a single step with Ni-NTA affinity chromatography. Tests were performed by ELISA to confirm the proteins immunological activity. Were proved the reaction of the recombinant proteins with the antibodies specific for respective virus (HBV and RV). This work is in process of adjustment of the ELISA for use of these proteins to detection of viral antibodies in sera from infected patients, which will be done by the company WAMA diagnóstica (project in partnership).Instituto de Ciências Biológicas (IB)Departamento de Biologia Celular (IB CEL)Programa de Pós-Graduação em Biologia MolecularporA concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessProdução e caracterização funcional de proteínas multiepitopos e uso como insumos biotecnológicos - hepatite B e rubéolainfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisRubéolaHepatite BDiagnóstico de laboratórioreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNBORIGINAL2011_MarilenQueirozdeSouza.pdf2011_MarilenQueirozdeSouza.pdfapplication/pdf3759732http://repositorio.unb.br/bitstream/10482/35926/1/2011_MarilenQueirozdeSouza.pdf2c206a72463ec6800b2fd46c3ae95ea9MD51open accessLICENSElicense.txtlicense.txttext/plain676http://repositorio.unb.br/bitstream/10482/35926/2/license.txt59c0495af143a2dbef8cb1eca992b8cfMD52open access10482/359262025-11-13 17:13:26.971open accessoai:repositorio.unb.br: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Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2025-11-13T20:13:26Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB) |
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