Produção em larga escala da lacase 1 recombinante de Cryptococcus neoformans no sistema de expressão heteróloga Pichia pastoris
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Os mecanismos de infecção e sua virulência são objeto de intensa investigação. A melanização do fungo é um dos fatores que aumenta sua virulência, e é catalisada por uma enzima chamada lacase 1 (Lac1). Além da atividade descrita, constatou-se que essa enzima pode ser um dos fatores que permite a sobrevivência do fungo no próprio líquido cefalorraquidiano (LCR), contribuindo para sua permanência no encéfalo. A levedura, Pichia pastoris, é um bom modelo para produção de proteínas, a cepa X-33 dessa levedura foi transformada por um plasmídeo contendo a sequência codante de Lac1, com o objetivo de produção de lacase recombinante. A expressão da enzima nos transformantes foi testada por ABTS, otimizada por testes de produção temporal e foi visto que, em frasco, diferentes tempos de indução não causam diferença significativas na produção da proteína. Além disso, entendeu-se que a Lac1 possui sensibilidade a alterações de pH, com atividade entre as faixas de 5,1 - 6,1 e que o aumento de escala para 1,5 litros de cultura leva a uma necessidade de aumento da frequência do fluxo de alimentação com o indutor metanol.Meningoencephalitis caused by the fungus Cryptococcus neoformans in immunocompromised patients, especially in those with HIV, has resulted in approximately 122,000 deaths per year. The mechanisms of infection and its virulence are the subject of intense investigation. Fungal melanization is one of the factors that enhance its virulence and is catalyzed by an enzyme called laccase 1 (Lac1). Furthermore, beyond the described activity, it has been observed that this enzyme might be one of the factors enabling the fungus to survive within the cerebrospinal fluid (CSF), contributing to its persistence in the brain. The yeast Pichia pastoris serves as a suitable model for protein production. The X-33 strain of this yeast was genetically transformed with a plasmid containing the coding sequence of Lac1, aiming to produce recombinant laccase. The expression of the enzyme in the transformed strains was assessed using ABTS, and optimization was achieved through temporal production tests. It was noted that, in flask cultures, varying induction times did not result in significant differences in protein production. Additionally, it was established that Lac1 exhibits sensitivity to pH changes, with optimal activity within the pH range of 5.1 - 6.1. Moreover, as the scale of production increased, it was observed that there was a need for an increased feeding rate with the inducer methanol.Instituto de Ciências Biológicas (IB)Departamento de Biologia Celular (IB CEL)Programa de Pós-Graduação em Biologia MicrobianaporA concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.unb.br, www.ibict.br, www.ndltd.org sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra supracitada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessProdução em larga escala da lacase 1 recombinante de Cryptococcus neoformans no sistema de expressão heteróloga Pichia pastorisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisPichia pastorisLacase 1Cryptococcus neoformansExpressão heterólogareponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNBORIGINALLarissaVerginiaDoNascimentoMiranda_DISSERT.pdfapplication/pdf1310644http://repositorio.unb.br/bitstream/10482/54948/1/LarissaVerginiaDoNascimentoMiranda_DISSERT.pdf31fcd3e00fbb41adc03666b791c12278MD51open access10482/549482026-06-19 16:59:44.84open accessoai:repositorio.unb.br:10482/54948Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2026-06-19T19:59:44Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB) |
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