O papel dos túneis de água na regulação da atividade enzimática de uma β-glicosidase de Humicola insolens (Bglhi)

• Main Author: Lopes, Douglas Christian Borges
• Publication Date: 2025
• Format: Doctoral thesis
• Language: por
• Source: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Download full: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17131/tde-05052025-140910/
• topic: β-glicosidase; β-glucosidase; Hidrólise; Hydrolysis; Mutagênese sitio-dirigida; Site-directed mutagenesis; Transglicosilação; Transglycosylation; Túneis de água; Water tunnels

As β-glicosidases (BGLs) são um grupo de enzimas que promovem a quebra de ligações glicosídicas específicas em moléculas de açúcar. Essas enzimas são cruciais na degradação de diversos tipos de açúcares complexos, incluindo celulose e outros polissacarídeos. As BGLs desempenham um papel fundamental na hidrólise de biomassa lignocelulósica, processo que visa transformar materiais vegetais em açúcares fermentáveis para a produção de biocombustíveis. Um aspecto notável das BGLs é a sua capacidade de tolerar e, em alguns casos, ser estimuladas pelo produto de sua própria reação, a glicose. Essa característica única tem sido objeto de intensas pesquisas nas últimas décadas, com o objetivo de compreender os mecanismos moleculares envolvidos nesse fenômeno e explorar suas aplicações biotecnológicas. O presente trabalho buscou identificar e avaliar como modificações em alguns resíduos de aminoácidos encontrados em túneis de água da Bglhi, uma β-glicosidase (GH1) proveniente de Humicola insolens que apresenta tanto atividade de hidrólise quanto transglicosilação, poderiam influenciar no balanço entre esses dois tipos de atividade. Essa enzima é descrita como sendo estimulada por glicose e xilose. As variantes mutantes da Bglhi foram obtidas através de mutações sítio-dirigidas. A enzima e suas variantes mutantes foram produzidas heterólogamente em E. coli, e caracterizadas quanto temperatura e pH ótimos, termotolêrancia, estabilidade em diferentes pHs, tolerância em diferentes concentrações de glicose e xilose, e também, obtidos os parâmetros cinéticos Km, Vmax e eficiência catalítica na presença de concentrações de glicose e xilose que estimulam o máximo da atividade enzimática. Além disso, foram avaliados os impactos das mutações nas taxas de hidrólise e transglicosilação, na presença e ausência de xilose. Foram obtidas 9 variantes mutantes da Bglhi (S54H, F115T, F115W, A260F, N432Q, S54H/F115W, S54H/A260F, F115W/A260F e S54H/F115W/A260F). Dentre as variantes mutantes, F115W/A260F não foi expressa de forma solúvel e N432Q não apresentou qualquer atividade e, portanto, não foram caracterizadas. Todas as variantes ativas e solúveis não apresentaram alterações quanto a temperatura e pH ótimos e estabilidade em diferentes pHs, contudo, S54H, A260F, S54H/F115W, S54H/A260F e S54H/F115W/A260F apresentaram menor termotolerância em temperaturas acima de 50 ºC quando comparadas com a enzima nativa. Os parâmetros cinéticos apresentaram variações em todas as variantes mutantes em comparação a Bglhi tanto na presença ou ausência de glicose e xilose. Da mesma foram ocorreram alterações nas taxas de transglicosilação das variantes mutantes frente a Bglhi. Esses dados indicam que modificações nos canais de água nesta enzima podem interferir, de alguma forma, no tipo de reação realizada por ela e, portanto, levando a uma possível elucidação de novos alvos para o desenvolvimento e engenharia de enzimas visando aprimorar não só β-glicosidases como também outras enzimas de interesse para diversos processos industriais.