Caracterização de PIMREG na sinalização de resposta ao dano no DNA em linhagem de células de glioblastoma tratadas com temozolomida

• Autor(a) principal: Mamede, Mariana Siqueira Lacerda
• Data de Publicação: 2024
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17136/tde-23012025-093429/
• topic: DDR; DDR; DSB; DSB; GBM; GBM; PIMREG; PIMREG

PIMREG (PICALM interacting mitotic regulator) é uma proteína descrita como um marcador de proliferação, altamente expressa em uma variedade de tecidos proliferativos, normais e tumorais. Dentre os tumores, glioblastoma (GBM) apresentou os mais altos níveis de expressão de PIMREG, segundo estudo recente publicado pelo grupo. GBM é o tumor primário do sistema nervoso central mais comum e mais agressivo em adultos. Pacientes com GBM possuem um mau prognóstico e considerável resistência ao tratamento padrão, que consiste em ressecção cirúrgica, seguida de radioterapia e quimioterapia adjuvante com temozolomida (TMZ). Ademais, aquele estudo sugeriu que o silenciamento de PIMREG sensibilizou as células de GBM ao tratamento com TMZ e prejudicou a ativação de p-ATM (S1981) e p-RPA32 (S33) nessas células. Nesse contexto, para entender o papel de PIMREG na resposta ao dano no DNA (DDR) e no reparo do DNA, inicialmente, populações de células de GBM monoclonais T98G PIMREG knockout (KO) foram geradas via CRISPR-Cas9. Células selvagens foram tratadas com concentrações crescentes de TMZ e a concentração de 300 μM foi escolhida para o tratamento das células, por não ocasionar parada do ciclo celular, nem morte celular. Os clones T98G PIMREG KO (KO-1#7, KO-2#7 e KO-3#4), bem como as células T98G selvagens, foram tratados com 300 μM de TMZ e a ativação de um painel de proteínas de DDR foi avaliado por western blotting. Os resultados mostraram que a redução da fosforilação do resíduo de S139 de H2A.X, utilizado como marcador de dano no DNA, ficou evidente em dois dos clones T98G PIMREG KO em relação às células T98G selvagens. Além de γH2A.X, foi constatada a redução de p-53BP1 (S1778) e aumento da fosforilação de p-KAP1 (S824), de p-CHK2 (T68) e de RPA32 nos resíduos de serina 8 e 33. Adicionalmente, a proteína endógena de PIMREG imunoprecipitada, a partir do lisado de células T98G selvagens tratadas com TMZ, foi marcada, via western blotting, com anticorpo contra os substratos de ATM e ATR. O sítio de fosforilação dessas quinases foi reconhecido, por esse anticorpo, no tamanho da banda correspondente à PIMREG. A imunoprecipitação reversa com anticorpo de substratos de ATM e ATR, quando submetida à marcação com anticorpo anti-PIMREG, também revelou a co-precipitação de PIMREG. Em resumo, esses resultados sugerem que PIMREG seja um potencial substrato de ATM e/ou ATR e esteja relacionado a DDR, visto a diminuição da fosforilação de um marcador de quebra de fita dupla do DNA nas células T98G PIMREG KO.