Caracterização do regulon Zur de Chromobacterium violaceum

• Main Author: Lima Neto, Sergio Pereira
• Publication Date: 2024
• Format: Master thesis
• Language: por
• Source: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Download full: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17136/tde-19022025-091723/
• topic: Chromobacterium violaceum; Chromobacterium violaceum; Bacterial genetics; Bacterial virulence; Genética de bactérias; Homeostase de zinco; Pequenas proteínas; Small proteins; Transporte de zinco; Virulência bacteriana; Zinc homeostasis; Zinc transport

O zinco é um micronutriente essencial para a manutenção da vida por atuar como cofator enzimático, desempenhando funções estruturais, catalíticas e regulatórias em proteínas. Entretanto, em excesso o zinco é tóxico para as células por causar a metalação incorreta de proteínas. A homeostase do zinco em bactérias envolve a regulação de diversos genes pelo fator de transcrição Zur. No patógeno ambiental Chromobacterium violaceum a captação de zinco é importante para virulência. Entretanto, pouco é conhecido sobre os genes regulados por Zur nesta bactéria. Neste trabalho, investigamos o regulon Zur de C. violaceum de modo global e caracterizamos com detalhes um gene regulado por Zur que codifica a proteína hipotética CV_RS15040. Usando sequenciamento de RNA (RNA-seq) das linhagens selvagem e Δzur e validação por RT-qPCR, foram identificados 23 genes diferencialmente expressos, sendo 9 genes com expressão aumentada e 14 genes com expressão diminuída no mutante Δzur. Os genes com aumentada expressão em Δzur incluem o operon zur com genes relacionados a captação de zinco (CV_RS15045, CV_RS15040, znuCBA) e zntA que codifica uma ATPase do tipo P de efluxo de zinco. Ensaios de EMSA indicaram a ligação direta de Zur de modo dependente de zinco ao promotor do operon zur, mas não ao promotor de zntA. Análises in silico revelaram que a pequena proteína CV_RS15040 de 63 aminoácidos possui uma região N-terminal desordenada rica em histidinas com potencial de ligar zinco e uma região transmembrana C-terminal. Uma linhagem mutante ΔCV_RS15040 obtida neste trabalho apresentou crescimento prejudicado em limitação de zinco, redução do conteúdo celular de zinco, aumento da expressão dos genes do operon zur e drástica redução de virulência em camundongos. Mutantes ΔznuA e ΔCV_RS15040znuA testados para algumas destas condições, apresentaram fenótipos similares ao mutante ΔCV_RS15040, sugerindo que CV_RS15040 deve atuar com o sistema ZnuABC na captação de zinco. Em resumo, este estudo demonstrou que Zur regula poucos genes em C. violaceum, incluindo a pequena proteína CV_RS15040 que é fundamental para homeostase do zinco e virulência desta bactéria.