Estabelecimento de modelo in vitro de epiderme humana reconstruída para dermatite atópica

• Main Author: Assis, Silvia Romano de
• Publication Date: 2024
• Format: Master thesis
• Language: por
• Source: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Download full: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9142/tde-19092024-120129/
• topic: Atopic Dermatitis; Conditioned medium from atopic fibroblasts; Dermatite atópica; Epiderme Humana Reconstruída para Dermatite Atópica; Meio Condicionado de Fibroblastos Atópicos; Reconstructed Human for Atopic Dermatitis

A Epiderme Humana reconstruída (RHE) é uma ferramenta valiosa na pesquisa dermatológica, particularmente no estudo da Dermatite Atópica (DA). A DA é uma doença inflamatória crônica da pele que afeta uma parte significativa da população global (em até 20% das crianças e 10% dos adultos), representando um desafio substancial para a saúde pública e encargos financeiros aos sistemas de saúde. É caracterizada por sintomas como pele seca, prurido intenso e lesões eczematosas, devido a uma barreira epidérmica prejudicada. A complexidade e a variabilidade da fisiopatologia da DA, tornam-na uma condição difícil de gerir e tratar. Portanto, a Epiderme Humana Reconstruída para Dermatite Atópica, permite examinar a fisiopatologia dessa doença e é uma vantagem tecnológica para desenvolvimento de tratamentos. Este projeto visa primeiramente melhorar o modelo RHE para Dermatite Atópica, baseado parcialmente na pesquisa de DE VUYST et al., 2016 e DO NASCIMENTO PEDROSA et al., 2016; após, incorporar abordagens diferenciadas como o uso de meios específicos de fibroblastos atópicos (MCFA) e finalizar explorando marcadores moleculares ligados a proliferação, diferenciação epidérmica e marcadores comumente alterados em DA, para melhor compreensão e tratamento da doença. Atualizamos o modelo USP-RHE (grupo 1/grupo controle/RHE-1) desenvolvido com células de indivíduos saudáveis, gerando três variantes: grupo RHE-2, grupo de indução de DA pela adição de interleucinas IL-4, IL-13 e IL-25, pós depleção de colesterol; grupo RHE- 3, grupo de indução de DA mais suplementação com MCFA e grupo RHE-4, grupo não induzido e que recebeu suplementação de MCFA. Avaliamos esses modelos utilizando histologia e imunofluorescência para identificar marcadores de desenvolvimento epidérmico normal e atópico, como citoqueratinas 10 e 14 (CK10 e CK14), filagrina (FLG), involucrina (IVL), loricrina (LOR), anidrase carbônica 2 (CA2), linfopoietina estromal tímica (TSLP) e Ki67. As análises moleculares incluíram RT-qPCR e Western blotting para avaliar expressões de mRNA e proteínas, garantindo uma avaliação completa da capacidade dos modelos de imitar com precisão as características epidérmicas. Complementando, dosamos a concentração de IL- 8 nos sobrenadantes das culturas. Nossos resultados mostram a presença de alterações entre as camadas da epiderme sugestivas de características de DA nos grupos RHE-2, RHE-3 e RHE-4 em relação ao grupo RHE-1. Presença de proteínas estruturais, porém, com diminuição de CK10 nos grupos RHE-2 e RHE-3 em relação aos grupos RHE-1 e RHE-4. Taxa de proliferação estável no grupo RHE-2 em relação ao grupo RHE-1. Diminuição na expressão de proteínas de diferenciação terminal epidérmica e aumento de expressão de CA2 nos grupos RHE-2 e RHE- 3 em relação ao grupo RHE-1. Secreção de IL-8 aumentada nos grupos RHE-2, RHE-3 e RHE- 4 em relação ao grupo RHE-1. O grupo RHE-3 parece oferecer uma representação mais complexa da DA, incorporando tanto a indução inflamatória quanto a influência do ambiente celular atópico (via MCFA), o que pode refletir de maneira mais abrangente as características da DA. Os grupos RHE-2 e RHE-3 demonstram ser capazes de mimetizar características da DA, o que contribui para o avanço da pesquisa dermatológica e abre caminhos para estratégias terapêuticas mais eficazes no manejo da Dermatite Atópica. O grupo RHE-4 sugere que o meio condicionado por si só, não é suficientemente capaz de reproduzir características da doença, exceto pela presença de espaços intercelulares dos queratinócitos nas camadas inferiores da epiderme. O grupo RHE-2 representa um grupo mais acessível, tornando-se o grupo de escolha como conclusão desse estudo.