Expressão do gene da glicocerebrosidase humana em Chlamydomonas reinhardtii

• Main Author: Pizzoli, Guilherme
• Publication Date: 2016
• Format: Master thesis
• Language: por
• Source: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS
• Download full: http://hdl.handle.net/10183/170066
• topic: Glicocerebrosidase; Chlamydomonas reinhardtii; Doença de Gaucher

Considerada a mais comum das doenças lisossômicas, a doença de Gaucher é causada por mutações no gene GBA1 que resultam na síntese defeituosa da enzima glicocerebrosidase (GBA), responsável pela hidrólise dos glicocerebrosídios em glicose e ceramida. A deficiência da enzima provoca o acúmulo desses glicolipídios nos macrófagos, principalmente no fígado, no baço e na medula óssea, levando a um fenótipo complexo. O tratamento da doença consiste na administração da enzima GBA humana (HsGBA) exógena e, apesar de sua eficácia, é extremamente oneroso. Assim como outras espécies de microalgas, Chlamydomonas reinhardtii apresenta alto potencial para a produção de grandes quantidades de proteínas recombinantes de forma rápida e a um custo muito inferior ao dos sistemas de expressão tradicionais. O objetivo proposto para o desenvolvimento deste trabalho foi a expressão do gene codificador da HsGBA a partir do genoma nuclear de C. reinhardtii visando à produção da proteína como possível alternativa para a terapia de reposição enzimática. O gene HsGBA artificial foi projetado com códons adaptados para a expressão nuclear em C. reinhardtii e com sítios de restrição. A sequência nucleotídica foi sintetizada pela empresa GenScript USA Inc. e, após seu recebimento em plasmídeo de clonagem, o gene HsGBA foi inserido no plasmídeo pHsp70A/RbcS2-cgLuc por restrição com endonucleases e ligação. Esse vetor foi combinado com o plasmídeo pKS-aph7``-lox para a transferência do cassete de expressão do gene de interesse por recombinação sítio específica mediada pelo sistema Cre/lox, originando o vetor pKS-aph7``-lox::HsGBA, que contém, assim, os cassetes de expressão em tandem para HsGBA e para o marcador de seleção aph7``, codificador da enzima aminoglicosídeo fosfotransferase e capaz de conferir resistência à higromicina B. A linhagem de C. reinhardtii CC-400 cw15 mt+ foi transformada por eletroporação com o plasmídeo resultante linearizado (clivado com EcoRV) e na forma circular. A integração de HsGBA no genoma de cinco linhagens de C. reinhardtii foi comprovada por PCR e sua expressão foi demonstrada em três dessas linhagens de forma qualitativa por RT-PCR. Como HsGBA é controlado por um promotor induzível, hsp70A, diversas condições foram testadas visando à sua máxima expressão. Entretanto, análises por SDS-PAGE e western blot não permitiram a detecção da proteína recombinante. De modo semelhante, a atividade enzimática da HsGBA avaliada em extratos proteicos de linhagens transformadas não foi diferente da observada para linhagens não transformadas de C. reinhardtii.