Detecção e diferenciação do vírus da bronquite infecciosa pela técnica de imunocaptura-RT-PCR E RFLP

• Main Author: Piza, Vanessa Mirabelli Toledo [UNESP]
• Publication Date: 2007
• Format: Master thesis
• Language: por
• Source: Repositório Institucional da UNESP
• Download full: http://hdl.handle.net/11449/94869
• topic: Frango de corte; Bronquite infecciosa em ave domestica; Diagnóstico molecular; Infectious bronchitis virus; Molecular diagnosis; Immunocapture; Variant characterization

Nesse estudo foi desenvolvido e aplicado o procedimento de imunocaptura para realizar a reação de transcrição reversa seguida pela reação em cadeia da polimerase (IC-RT-PCR) a fim de ser amplificada uma região 5'_ proximal do gene 81 do vírus da bronquite infecciosa (VBI) com 228 pb e de forma a fazer a detecção e a diferenciação desse vírus, comparando-se os resultados dessa metodologia com os obtidos na técnica convencional de RT-PCR. Todas as 11 estirpes do VBI testadas foram amplificadas pelas duas técnicas moleculares, enquanto que nenhum dos vírus heterólogos (Pneumovírus Aviário do grupo A e B, Vírus da Doença de Gumboro e o Vírus da Doença de Newcastle) ensaiados levaram a amplificação específica do gene 81. O limiar de detecção para a técnica de IC-RT-PCR foi idêntico ao do método de RT-PCR e correspondeu a 102.8 Doses Infectantes Embrionárias 50%. Para um total de 35 amostras de tecidos do trato respiratório testadas e provenientes de aves infectadas experimentalmente, 32 foram positivas pela técnica de IC-RT-PCR e também pela RT-PCR convencional, enquanto que o isolamento viral foi obtido para 22 dessas amostras. A análise do produto amplificado do gene 81 na IC-RT-PCR através da técnica de RFLP (restriction fragment length polymorphism), com as enzimas Alul e Mboll, permitiu a diferenciação das 5 estirpes de referências e dos 6 isolados de campo analisados em 4 diferentes genótipos, correspondentes às estirpes de referência M41, Connecticut, ou 8E-17, ou a um isolado de campo. Portanto, a técnica de IC¬RT -PCR demonstrou um grande potencial para ser aplicada no diagnóstico direto do VBI, apresentando vantagens sobre a técnica convencional de RT-PCR, as quais foram derivadas da combinação da especificidade da imunocaptura em fase sólida com a sensibilidade da reação de PCR, o que pode proporcionar ganho de tempo e menor custo para a manipulação de um maior número de amostras.