Impacto da mutação BCG Moreau-específica em PhoR na sua atividade histidina kinase

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Main Author: Souza, Juliana Regina Ribeiro de
Publication Date: 2016
Format: Bachelor thesis
Language: por
Source: Repositório Hórus
Download full: http://hdl.handle.net/unirio/11297
Summary: Orientadora científica: Leila de Mendonça Lima; Coorientadora científica:Teca Calcagno Galvão
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spelling Impacto da mutação BCG Moreau-específica em PhoR na sua atividade histidina kinaseImpact of a BCG Moreau-especific mutation in PhoR histidine Kinase activityOutrosBiomedicinafunctional genomicsmycobacteriamutationgenômica funcionalmicobactériasmutaçãoOrientadora científica: Leila de Mendonça Lima; Coorientadora científica:Teca Calcagno GalvãoCNPQFrom attenuation of a clinic isolate from Mycobacterium bovis it was obtained the BCG vaccine, which was then distributed all around the world, and it had been propagated through serial passages until the development of seed stocks. As a result of this process, there is a family of BCG strains, with phenotypic and genotypic differences. The Brazilian BCG strain is called Moreau. Its origin date from 1927 and its current administration represents a 99% Brazilian population coverage. This strain shows an interesting non-synonymous mutation, D322G, at histidine kinase phoR. Two component systems (TCS) are bacterial signal transduction pathways consisting in a histidine kinase (HK) and an answering regulator (AR). PhoR is a HK that autophosphorylate itself and transfer the phosphate group to phoP, the AR for this TCS, which triggers the gene regulation of its regulon. The TCS PhoP-PhoR is important in Mycobacterium tuberculosis and M. bovis virulence. When PhoP is inactivated, we have M. tuberculosis attenuation, and so bacteria can´t propagate in animal models or in macrophages. With that, we propose to investigare if the BCG-Moreau specific mutation in PhoR has a functional impact, changing its HK activity. The BCG Pasteur (reference strain) and BCG Moreau phoR genes and BCG Moreau phoP gene were amplified by PCR using a high fidelity DNA polymerase, then they were cloned using Gibson method in a heterologous expression vector, and then clones were obtained after Esherichia coli eletroporation. It was identified plasmids containing phoP or phoR (Moreau and Pasteur) by colony PCR, and then it was performed a plasmid extraction, directional digestion with restriction enzymes (AflIII, BglII, NcoI-XhoI), DNA sequencing, expression and solubility tests and polyclonal antibodies production from rPhoP. Expression and solubility tests were done with several E. coli strains (BL21 (DE3), Origami (DE3) and Rosettagami (DE3)), in different temperatures and medium composition. However, it was not yet identified a condition in which recombinant protein is produced mainly in soluble form, which is necessary to the PhoR autophosphorylation assays and PhoP phosphorylation assay. Insoluble PhoP was purified after urea solubilization and it was used for polyclonal antibodies production after inoculation in BalbC mice.n/aPela atenuação de um isolado clínico de Mycobacterium bovis obteve-se a vacina BCG, que foi distribuída ao redor do mundo, havendo propagação por passagem serial por anos até a implantação de lotes sementes. Como resultado, existe uma família de cepas BCG, com características fenotípicas e genotípicas diferentes. A cepa utilizada no Brasil é a BCG Moreau. Sua origem foi definida como sendo em 1927 e sua aplicação atualmente representa cobertura de 99% na população brasileira. Essa cepa apresenta uma interessante mutação não sinônima, D322G, na histidina kinase PhoR. Sistemas de dois componentes (SDC) são vias de tradução de sinal bacterianas, que consistem em uma histidina kinase (HK) e um regulador de resposta (RR). PhoR é uma HK que se autofosforila e transfere o grupo fosforil a PhoP, o RR deste SDC, que dispara a ativação dos genes no regulon. O SDC PhoP-PhoR é importante na virulência de Mycobacteriumtuberculosis e M. bovis. Quando PhoP é inativado, há atenuação de M. tuberculosis fazendo com que a bactéria não se propague em modelos animais ou em macrófagos. Visto isso, nos propomos a averiguar se a mutação de PhoR específica a BCG Moreau tem impacto funcional, alterando sua atividade de HK. Os genes phoR de BCG Pasteur (cepa referência) e BCG Moreau e phoP de BCG Moreau foram amplificados por PCR com DNA polimerase de alta fidelidade, clonados com o método de Gibson em vetor de expressão heteróloga, clones foram obtidos após eletroporação em Escherichia coli. Foram identificados plasmídeos contendo phoP ou phoR (Moreau e Pasteur) por PCR de colônia, realizando posteriormente extração de plasmídeo, digestão direcional com as enzimas AflIII, BglII, NcoI-XhoI e sequenciamento de DNA, expressão e teste de solubilidade e produção de anticorpos policlonais de rPhoP. Os testes de expressão e solubilidade foram realizados em várias estirpes de E.coli (BL21 (DE3), Origami (DE3) e Rosettagami (DE3)), temperaturas e meios. No entanto, não foi ainda identificada uma condição na qual as proteínas são produzidas em abundância em formas solúvel, o que seria necessário para os ensaios de autofosforilação de PhoR e ensaios de fosforilação de PhoP. PhoPinsolúvel foi purificada após solubilização com uréia e usada para obtenção de anticorpos policlonais a partir da inoculação em camundongos BalbC.Dumans, Ana Teresa NogueiraDumans, Ana Teresa NogueiraLima, Leila de MendonçaNascimento, Cláudia JorgeSchwarz, Marcos Gustavo AraujoSouza, Juliana Regina Ribeiro de2018-03-09T15:09:14Z2018-03-09T15:09:14Z2016-12-19info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/bachelorThesisSOUZA, Juliana Regina Ribeiro de. Impacto da mutação BCG Moreau-específica em PhoR na sua atividade histidina kinase. 2016. 58 f. 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