Purificação, caracterização bioquimica e funcional de uma serinoprotease (Uruprot) do veneno de Bothrops alternatus (Urutu)

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Main Author: Ribeiro, Dulcineia Aparecida
Publication Date: 2000
Format: Master thesis
Language: por
Source: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Download full: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1589360
Summary: Orientador: Jose Camillo Novello
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spelling Purificação, caracterização bioquimica e funcional de uma serinoprotease (Uruprot) do veneno de Bothrops alternatus (Urutu)Cobra venenosa - VenenoOrientador: Jose Camillo NovelloDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Venenos de serpentes contêm uma ampla variedade de enzimas. As proteases purificadas de veneno são geralmente dassificadas por sua estrutura em: serinoproteases e metaloproteases, e apresentam potente efeito na ativação ou inibição da coagulação sangüínea, agindo na hemostasia, trombose, fibrinólise e agregação plaquetária. A presente dissertação teve por objetivo purificar e caracterizar a serinoprotease Uruprot do veneno de Bothrops altematus, uma serpente da família Viperidae. Uruprot foi purificada em dois passos cromatográficos: Sephadex G75 e DEAE 5PW, em sistema HPLC. A homogeneidade de Uruprot foi monitorada em gel SDS-PAGE e em coluna de fase reversa C18. O gel de eletroforese em condições desnaturantes evidenciou uma banda com massa molecular aparente de 32 kDa na presença de 0,1 M de DTT, sugerindo que esta é formada por uma única cadeia polipeptídica. A eletroforese de duas dimensões de Uruprot demonstrou ser seu ponto isoelétrico em torno de 4,6, confirmando massa molecular observada em SDS-PAGE. A análise da composição de aminoácidos de Uruprot apresentou alta concentração dos aminoácidos glicina, treonina, fenilalanina, isoleucina, serina e glutamina e baixos níveis de aminoácidos básicos como histidina e arginina, ratificando o resultado da 2D caracterizando um pl ácido. Uruprot teve reação positiva quando submetida à coloração para carboidrato, sugerindo a existência de carboidratos ligados covalentemente à sua estrutura. O estudo da homologia seqüencial da região N-terminal da seqüência consenso (WGGDECNINEHR-LVAI) indicou alto grau de homologia com as serinoproteinases: TVSPA (94%), KLE 11 (94%) e Ancrod (92%) entre outras. Uruprot não induziu a agregação em plaquetas lavadas, mas inibiu a indução da aglutinação de eritrócitos na presença de Ristocetina na concentração mínima de 1 O ~g/mL. O conjunto de resultados obtidos com Uruprot monstram fortes indícios de que essa pode desempenhar a função de ativadora do plasminogênio, entretanto o papel da atividade "in vivo" das serinoproteases de venenos em envenenamentos patológicos é pouco conhecido. Estudos adicionais são necessários para a obtenção de maiores informações sobre esse grupo de enzimasAbstract: Snake venoms contain a high variety of toxic compounds and enzymes. Venom purified proteases are structurally dassified as serine proteases and metalloproteases, and showa potent effect on blood coagulation, acting on hemostasis, thrombosis, fibrinolysis and platelet aggregation. The aim of this work was the purification and characterization of a serine protease from the venom of Bothrops altematus snake, called Uruprot. Uruprot was purified in a two step chromatography: Sephadex G-75 and DEAE 5PW both in HPLC system. Its homogenity was monitored in SDS-PAGE and reversedphase C18 chromatography. In denaturing conditions, 0,1 M DTT, a band of 32 kDa apparent molecular mass was evidenced, suggesting that the protein consists in one polypeptidic chain. The two dimensional electrophoresis of Uruprot showed its isoelectric point at about 4,6, confirming the apparent molecular mass observed in SDS-PAGE. Uruprot's amino acid analysis composition showed a high concentration of glycine, threonine, phenylalanine, isoleucine, serine and glutamine and low levels of basic amino aCids, as histidine and arginine, ratifying the result obtained from bidimensional electrophoresis wich showed an acid pl. Uruprot showed a positive reaction when submitted to carbohydrate coloration indicating the presence of carbohydrate covalentely bound to its structure. The N-terminal sequence homology study showed a consensus sequence (WGGDECNINEHR-LVAI) and indicated a high homology with serine proteinase TSV-PA (94%), KLE 11 (94%), Ancrod (92%), and others. Uruprot did not induce platelet aggregation but inhibits erytrocytes agglutination in the presence of ristocetin, in a minimum concentration of 10llg/mL. Ali the results obtained indicates that Uruprot is a serine protease plasminogen activator, however, the role of "in vivo" activity of venom serine proteases in envenomation remains unclear. Additional studies are necessary to provide more information about this enzyme grouMestradoBioquímicaMestre em Biologia Funcional e Molecular[s.n.]Novello, Jose Camillo, 1955-2022Macedo, Maria Lígia RodriguesToyama, Marcos HikariPaula, Eneida deUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de BiologiaPrograma de Pós-Graduação em Biologia Funcional e MolecularUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASRibeiro, Dulcineia Aparecida20002000-12-14T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdf80p. : il.(Broch.)https://hdl.handle.net/20.500.12733/1589360RIBEIRO, Dulcineia Aparecida. Purificação, caracterização bioquimica e funcional de uma serinoprotease (Uruprot) do veneno de Bothrops alternatus (Urutu). 2000. 80p. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1589360. 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