L-asparaginase de Penicillium sizovae, produção nativa e heteróloga

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Main Author: Guimarães, Marina Borges
Publication Date: 2024
Format: Doctoral thesis
Language: por
Source: Repositório Institucional da UnB
Download full: http://repositorio.unb.br/handle/10482/52351
Summary: Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2024.
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spelling L-asparaginase de Penicillium sizovae, produção nativa e heterólogaL-asparaginaseLeucemia linfoblástica aguda (LLA)Fungos filamentososExpressão heterólogaTese (doutorado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2024.A enzima L-asparaginase (L-ASNase) foi a primeira enzima terapêutica descoberta e é utilizada no tratamento de leucemia Linfoblástica aguda (LLA). Seu mecanismo de ação consiste em catalisar a hidrólise da L-asparagina em L-ácido aspártico e amônia. Apesar de ser a primeira linha de tratamento para a LLA, ainda não existe produção de L-ASNase no Brasil. Além disso, todos as formulações de L-ASNase aprovadas e disponíveis no mercado são de origem bacteriana (de Escherichia coli nativa e peguilada, e de Dickeya dadantii), entretanto estas formulações podem causar toxicidade e hipersensibilidade em alguns pacientes. Visando a produção de uma LASNase com efeitos adversos menores e maior rendimento, este trabalho tem como objetivo a investigação da L-ASNase do fungo Penicillium sizovae, isolado a partir do solo do cerrado. Duas abordagens foram avaliadas neste trabalho: a enzima nativa e a enzima heteróloga, expressa em sistema E. coli BL21(DE3). A produção da enzima nativa foi avaliada considerando condições de baixo custo e menor impacto ambiental, com uso de sistemas aquosos bifásicos (SABs) para a purificação. O SAB escolhido foi composto por PEG-2000/tampão fosfato, com fator de purificação (FP) de 1,63, dentre as condições avaliadas. Posteriormente, a cromatografia de troca iônica foi empregada, com rendimento de até 33,66% e FP de até 8,49. Em relação à enzima recombinante, sua clonagem e expressão em E. coli BL21(DE3) foram confirmadas por PCR, SDS-PAGE e Western Blot, ensaios que também confirmaram a presença enzima majoritariamente nas frações insolúveis, sugerindo a formação de corpos de inclusão (CI). As condições de cultivo, incluindo concentração de indutor, tempo pósindução e temperatura de indução foram otimizadas. Ensaios de solubilização com hidrocloreto de guanidina (GdnHCl) foram conduzidos, sendo a condição de cultivo de 0,1 mM de IPTG, 2 h, 37 ºC e 3 M de GdnHCl se destacou quanto à concentração de proteína e tamanho da banda correspondente à L-ASNase em SDS-PAGE. Matrizes experimentais com a finalidade de encontrar aditivos adequados para o redobramento foram realizadas, obtendo-se a enzima em tetrâmero após a adição de cátions divalentes, entretanto, sem atividade catalítica. Avaliações da construção do plasmídeo, do vetor, da linhagem celular e da expressão devem ser realizadas para que a enzima apresente atividade enzimática.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAPDF).The enzyme L-asparaginase (L-ASNase) was the first therapeutic enzyme discovered and is used in the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL). Its mechanism of action involves catalyzing the hydrolysis of L-asparagine into L-aspartic acid and ammonia. Despite being the first-line treatment for ALL, there is still no production of L-ASNase in Brazil. Additionally, all approved and available L-ASNase formulations on the market are of bacterial origin (from native and pegylated Escherichia coli, and Dickeya dadantii); however, these formulations may cause toxicity and hypersensitivity in some patients. Aiming to produce an L-ASNase with fewer adverse effects and higher yield, this work focuses on investigating the L-ASNase from the fungus Penicillium sizovae, isolated from Cerrado soil. Two approaches were evaluated in this study: the native enzyme and the heterologous enzyme expressed in the E. coli BL21(DE3) system. The production of the native enzyme was assessed under lowcost and environmentally friendly conditions, using aqueous two-phase systems (ATPS) for purification. The chosen ATPS was composed of PEG-2000/phosphate buffer, yielding a purification factor (PF) of 1.63 among the conditions evaluated. Subsequently, ion-exchange chromatography was employed, achieving up to 33.66% yield and a PF of up to 8.49. For the recombinant enzyme, its cloning and expression in E. coli BL21(DE3) were confirmed by PCR, SDS-PAGE, and Western Blot, which also showed the enzyme's presence predominantly in the insoluble fractions, suggesting the formation of inclusion bodies (IBs). The cultivation conditions, including inducer concentration, post-induction time, and induction temperature, were optimized. Solubilization assays with guanidine hydrochloride (GdnHCl) were conducted, with the cultivation condition of 0.1 mM IPTG, 2 h, 37 ºC, and 3 M GdnHCl standing out in terms of protein concentration and the corresponding L-ASNase band size in SDS-PAGE. Experimental matrices were developed to identify suitable additives for refolding, obtaining the enzyme in tetramer form after the addition of divalent cations; however, it lacked catalytic activity. Further assessments of plasmid construction, vector selection, cell strain, and expression conditions are necessary to achieve enzymatic activity.Faculdade de Ciências da Saúde (FS)Programa de Pós-Graduação em Ciências da SaúdeBatista, Pérola de Oliveira Magalhães DiasPereira, Jorge Fernando BrandãoGuimarães, Marina Borges2025-06-25T13:03:45Z2025-06-25T13:03:45Z2025-06-252024-11-26info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfGUIMARÃES, Marina Borges. L-asparaginase de Penicillium sizovae, produção nativa e heteróloga. 2024. 225 f., il. Tese (Doutorado em Ciências da Saúde) — Universidade de Brasília, Brasília, 2024.http://repositorio.unb.br/handle/10482/52351porA concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.unb.br, www.ibict.br, www.ndltd.org sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra supracitada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2025-06-25T13:03:45Zoai:repositorio.unb.br:10482/52351Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2025-06-25T13:03:45Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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