Análise da dieta de morcegos insetívoros em ambientes cavernícolas através de metabarcoding de eDNA

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Main Author: JORDÃO, Ana Cláudia da Silva Jardelino
Publication Date: 2019
Format: Master thesis
Language: por
Source: Repositório Institucional da UFPE
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Summary: JORDÃO, Ana Cláudia da Silva Jardelino, também é conhecido(a) em citações bibliográficas por: JARDELINO, Ana Cláudia da Silva
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spelling Análise da dieta de morcegos insetívoros em ambientes cavernícolas através de metabarcoding de eDNAQuirópterosArtrópodesGuanoJORDÃO, Ana Cláudia da Silva Jardelino, também é conhecido(a) em citações bibliográficas por: JARDELINO, Ana Cláudia da SilvaOs morcegos insetívoros são indicados como principais consumidores noturnos de insetos, incluindo espécies consideradas pragas agrícolas e vetores de doenças para humanos. A maioria das identificações dos artrópodes consumidos é realizada através da observação direta das fezes e/ou do conteúdo estomacal dos morcegos, dificultando a identificação específica das presas. Recentemente, para facilitar esta identificação, desenvolveram-se técnicas moleculares não invasivas como metabarcoding atrelado ao sequenciamento de alto rendimento. Mediante este processo é possível realizar o sequenciamento simultâneo de diferentes DNAs extraídos de amostras de materiais conglomerados, como o guano dos morcegos. Estudos que utilizam DNA ambiental precisam da padronização dos procedimentos moleculares e os protocolos devem ser testados em quaisquer estudos iniciais. Amostras provenientes de cavernas na Caatinga, em Pernambuco, na Mata Atlântica, em Sergipe, e na Floresta Amazônica, no Pará, foram armazenadas em etanol 96%, em solução de estabilização RNA Later ou in natura e posteriormente congeladas em ultra freezer -80ºC. Portanto, neste estudo foram testados esses três métodos de estocagem de guano, dois kits de extração de DNA e a padronização da amplificação, incluindo a escolha dos iniciadores para o gene mitocondrial Citocromo C Oxidase I. Para isso, foram selecionados três conjuntos de iniciadores diferenciando-se pelo tamanho adequado a tecnologia de sequenciamento de nova geração Illumina: UEA2/UEA3 (130 pb) sequenciado no MiniSeq (paired-end 300 ciclos), UEA3/UEA4 (370 pb) e UEA5/UEA6 (350 pb), ambos sequenciados no MiSeq (paired-end 600 ciclos). As sequências geradas foram agrupadas em unidades taxonômicas operacionais (OTUs). A coleta de guano em todas as cavidades resultou num total de 397 amostras. Deste total, 250 amostras foram selecionadas para a extração do DNA. Para os testes de estocagem, extração e amplificação do DNA foram selecionadas doze amostras. O método de armazenamento mais eficaz foi in natura, seguido daquele com adição de buffer e por último a adição de etanol 96%. Para os testes de amplificação com os três conjuntos de iniciadores foram selecionadas 13 amostras. Após os testes com os iniciadores, o fragmento de 130 pb foi selecionado para o sequenciamento de 29 amostras. Neste sequenciamento foram geradas 13.636 OTUs. Destas, 1.117 OTUs (8,2%) possuem similaridade igual ou acima de 97% com o banco de dados de nucleotídeos do NCBI e 408 OTUs (2,98%) são representativas para táxons de artrópodes com similaridade igual/acima de 97%. Lepidoptera e Diptera foram as ordens mais frequentes nas amostras, incluindo espécies pragas agrícolas e vetores de doenças. A diversidade dos itens alimentares encontradas na dieta dos morcegos insetívoros reforça a capacidade desses animais na prestação dos serviços ecossistêmicos, principalmente quando suprimem artrópodes que podem causar prejuízos à agricultura e outros que podem ser transmissores de doenças.FundepInsectivorous bats are indicated as the main nocturnal insect consumers, including species considered agricultural pests and disease vectors for humans. Most of the arthropod identifications consumed are carried out by direct observation of feces and / or stomach contents of bats, making it difficult to identify prey specimens. Recently, to facilitate this identification, non-invasive molecular techniques have been developed as metabarcoding coupled to high throughput sequencing. Through this process it is possible to carry out the simultaneous sequencing different DNA extracted from samples of conglomerate materials, such as guano from bats. Studies using environmental DNA require the standardization of molecular procedures and protocols should be tested in any initial studies. Samples from caves in the Caatinga, Pernambuco, Mata Atlântica, Sergipe, and the Amazon Forest, Pará, were stored in 96% ethanol, in a stabilization solution of RNA Later or in natura and then frozen in an ultra-freezer at -80ºC. Therefore, three methods of guano storage, two DNA extraction kits and the standardization of amplification, including the choice of primers for the mitochondrial Cytochrome C Oxidase I gene, were tested in this study. Three sets of primers were selected, differentiated by the size of the next-generation Illumina sequencing technology: UEA2 / UEA3 (130 bp) sequenced in the MiniSeq (paired-end 300 cycles), UEA3 / UEA4 (370 bp) and UEA5 / UEA6 (350 bp), both sequenced in MiSeq (paired-end 600 cycles). The sequences generated were grouped into operational taxonomic units (OTUs). The collection of guano in all wells resulted in a total of 397 samples. From this total, 250 samples were selected for DNA extraction. For the DNA storage, extraction and amplification tests, twelve samples were selected. The most effective storage method was in natura, followed by that with buffer addition and finally the addition of 96% ethanol. For the amplification tests with the three sets of primers, 13 samples were selected. After testing the primers, the 130 bp fragment was selected for the sequencing of 29 samples. In this sequencing were generated 13,636 OTUs. These OTUs, 1,117 OTUs (8.2%) have similarity to or above 97% with the NCBI nucleotide database and 408 OTUs (2.98%) are representative for arthropod taxa with similarity to above 97%. Lepidoptera and Diptera were the most frequent orders in the samples, including agricultural pests and disease vectors. The diversity of food items found in the diet of insectivorous bats reinforces the ability of these animals to provide ecosystem services, especially when they suppress arthropods that can cause damage to agriculture and others that may be disease vectors.Universidade Federal de PernambucoUFPEBrasilPrograma de Pos Graduacao em Biologia AnimalBERNARD, EnricoOLIVEIRA, Guilherme Corrêa dehttp://lattes.cnpq.br/5686803882338303http://lattes.cnpq.br/9700792111588336http://lattes.cnpq.br/8563794592947521JORDÃO, Ana Cláudia da Silva Jardelino2019-11-20T16:57:00Z2019-11-20T16:57:00Z2019-02-21info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfJORDÃO, Ana Cláudia da Silva Jardelino. Análise da dieta de morcegos insetívoros em ambientes cavernícolas através de metabarcoding de eDNA. 2019. Dissertação (Mestrado em Biologia Animal) – Universidade Federal de Pernambuco, Recife, 2019.https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/35299porAttribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazilhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/info:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UFPEinstname:Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)instacron:UFPE2019-11-21T05:16:39Zoai:repositorio.ufpe.br:123456789/35299Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.ufpe.br/oai/requestattena@ufpe.bropendoar:22212019-11-21T05:16:39Repositório Institucional da UFPE - Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)false
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