Avaliação da expressão das enzimas envolvidas no metabolismo da adenosina em linhas celulares de glioblastoma e em astrócitos

• Main Author: Honório, Ana Cláudia Batista
• Publication Date: 2020
• Format: Master thesis
• Language: por
• Source: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
• Download full: http://hdl.handle.net/10400.6/10847
• topic: Adenosina:metabolismo; Enzimas; Glioblastoma

O glioblastoma é um tumor de grau IV do sistema nervoso central e é caracterizado pelo seu crescimento infiltrativo. A falta de oxigenação, também conhecida por hipóxia, promove a invasão tumoral nos tecidos saudáveis do cérebro, como forma de mecanismo de escape a este ambiente adverso. Nestas condições, há um aumento na concentração de nucleótidos e nucleósidos extracelulares, particularmente a adenosina (Ado), sendo este considerado um mecanismo de proteção endógeno durante a hipóxia. A concentração extracelular basal de Ado encontra-se normalmente entre 30 – 200 nM, no entanto esta pode aumentar por dois mecanismos: hidrólise enzimática do ATP extracelular a AMP e posterior hidrólise deste a Ado através da ação da ecto-5’-nucleotidase (NT5E), ou efluxo da Ado pelos transportadores de nucleósidos bidirecionais (ENTs) após a sua produção intracelular. Intracelularmente, a Ado pode ser formada a partir do AMP através da acção da 5’-ectonucleotidase, ou hidrólise da S-adenosil-L-homocisteína catalisada pela Sadenosil-homocisteinase (AHCY). A adenosina pode ser consumida intracelularmente por fosforilação a AMP catalisada pela cinase da adenosina (ADK), no entanto, também pode ocorrer a hidrólise a inosina através da desaminase da adenosina (ADA). As concentrações intra- e extracelulares da Ado são mantidas em equilíbrio pelos ENTs – ENT1 e ENT2, que transportam este metabolito de acordo com o gradiente de concentração. Resultados anteriores indicam que a produção de adenosina está aumentada no glioblastoma (GBM), onde pode desempenhar um papel na progressão do tumor. O principal objetivo deste trabalho é avaliar a expressão das enzimas envolvidas no metabolismo da Ado, quer em situação de concentrações de adenosina basais quer aumentadas, em linhas celulares de glioblastoma e compará-la com a expressão observada em astrócitos humanos (HA). O efeito do aumento da concentração de adenosina na proliferação/viabilidade celular será também avaliado. Foram testadas 3 linhas de GBM: U87, SNB19 e U373. A expressão enzimática foi analisada por qPCR e a viabilidade/proliferação celular foi avaliada pelo método do MTT. Os resultados obtidos mostram que a Ado (30 µM) adicionada exogenamente diminui a proliferação/viabilidade celular em astrócitos apenas quando os recetores da adenosina são bloqueados pela presença de um cocktail de antagonistas (CA), enquanto o aumento da concentração de adenosina por inibição do seu consumo utilizando um inibidor da ADK, o ABT-702 (30 µM), diminui a viabilidade/proliferação celular tanto nos astrócitos como nas linhas celulares de GBM, quer na presença quer na ausência de CA, sugerindo um efeito não mediado por recetor. Relativamente à expressão do mRNA, comparativamente a HA, a expressão de ADK está aumentada nas linhas U373 e SNB19 enquanto a ADA está aumentada apenas na linha SNB19. Relativamente à expressão dos ENTs, o ENT1 está aumentado em células U373 e U87 enquanto o aumento da expressão do ENT2 foi observado apenas em U373, comparativamente a HA. Observou-se ainda uma diminuição da expressão de NT5E em U373 e SNB19 e um aumento em U87, relativamente a HA. Não foi observada diferenças de expressão da AHCY em qualquer das linhas comparativamente a HA. Comparativamente com o controle, o aumento da concentração de adenosina produziu uma diminuição na expressão da ENT2, nas linhas celulares U373 e U87, e na ENT1, nas células U373. Em HA e em células U373 a expressão de NT5E foi aumentada, enquanto nas células U87 foi reduzida pelos níveis elevados de adenosina. Um aumento da concentração de adenosina produziu aumento da expressão de AHCY em HA. Não foi observada modificação na expressão de nenhum dos genes analisados na linha celular SNB19 por aumento da concentração de adenosina. Em conclusão, observam-se diferenças significativas entre os astrócitos e as linhas celulares de glioblastoma, quer nos níveis de expressão das enzimas envolvidas no metabolismo da adenosina quer na resposta dessa expressão face ao aumento da concentração de adenosina.