Investigating BDNF receptor cleavage in an in vivo model of epilepsy
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| Data de Publicação: | 2023 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/62861 |
Resumo: | Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2023 |
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Investigating BDNF receptor cleavage in an in vivo model of epilepsyFator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)Receptor trkBNeurogéneseEpilepsiaDomínio/Área Científica::Ciências MédicasTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2023A epilepsia é uma perturbação cerebral caracterizada pela predisposição para gerar crises espontâneas recorrentes. A sincronização repentina e temporária da atividade neuronal devido a um desequilíbrio entre a neurotransmissão inibitória, mediada pelo GABA, e excitatória, mediada pelo glutamato, é o mecanismo responsável pelas crises. Trata-se de uma doença com elevada prevalência, afetando cerca de 50 milhões de pessoas, no entanto, cerca de 30% dos doentes sofrem de epilepsia refratária à terapêutica farmacológica, necessitando de recorrer a estratégias mais invasivas para o controlo sintomático da doença. Segundo a mais recente classificação da ILAE, esta patologia é categorizada em generalizada, focal e com início desconhecido. A variante mais frequente de epilepsia focal em seres humanos é a epilepsia do lobo temporal, acometendo principalmente o hipocampo. A epileptogénese é o processo pelo qual um cérebro saudável, após um insulto, desenvolve crises espontâneas. No entanto, há necessidade de esclarecer a fisiopatologia deste processo para a criação de novas estratégias terapêuticas. As mudanças na fisiologia do cérebro, como as alterações na sinalização do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e do seu recetor de tropomiosina B (TrkB-FL) contribuem para a fisiopatologia desta doença. O BDNF é responsável por processos de neuroprotecção endógena, tais como a sobrevivência neuronal e a neurogénese. Na presença de condições excitotóxicas, os recetores TrkB-FL são clivados por calpaínas dando origem a um recetor truncado, TrkB-T’, e a um fragmento intracelular, TrkB-ICD, comprometendo, assim, as ações neuroprotetoras do BDNF. Num modelo in vitro de status epilepticus (SE) foi demonstrado níveis diminuídos de TrkB-FL e níveis aumentados de TrkB-T’, o que sugere que o recetor é clivado nestas condições de SE. Já foi demonstrado que níveis elevados de BDNF num contexto pós crise, pode induzir uma forma aberrante de neurogénese e a dispersão das fibras musgosas. Além disso, previamente, um estudo recente revelou que o TrkB-ICD é uma proteína capaz de se deslocar até ao núcleo da célula e fosforilar diversas proteínas, alterando, desta forma a expressão génica no contexto da epilepsia. Estudos in vitro, in vivo e ex vivo, num contexto de doença de Alzheimer, revelaram a capacidade do TAT-TrkB em inibir a clivagem do TrkB-FL e de restaurar a sinalização BDNF/TrkB. No entanto, a caracterização da clivagem do TrkB-FL no modelo in vivo e a formação e função do TrkB-ICD continuam por esclarecer na epilepsia. O principal objetivo desta tese foi compreender o mecanismo pelo qual o BDNF está implicado na epileptogénese e perceber o papel da clivagem do TrkB-FL e a sua modulação num modelo experimental de epilepsia. De forma a desenvolver um modelo experimental, ratos Sprague-Dawley machos com 7 semanas foram injetados com kainato (KA) (10 mg/kg, intraperitoneal, ip). O modelo de epilepsia induzida por KA revelou ter sido bem estabelecido, uma vez que permitiu a ocorrência de crises espontâneas após 4 semanas da sua administração. Para o estudo da clivagem do TrkB-FL foram formados dois grupos: 1) animais sacrificados 1.5-4 horas após o KA e que apenas tiveram SE; 2) animais sacrificados 4 semanas após o KA e que desenvolveram epilepsia. Os animais controlo foram injetados com solução salina. As crises foram caracterizadas utilizando a Escala de Racine Modificada. Neste estudo, a proliferação neuronal foi avaliada através da coloração com Ki67, os neurónios hipocampais foram avaliados através do NeuN e a dispersão das fibras musgosas foi avaliada através da sinaptoporina. Para estudar o impacto da modulação na sinalização BDNF/TrkB, foram criados quatro grupos: 1) controlo; 2) TAT-TrkB; 3) KA, e 4) TAT-TrkB+KA. Todos os grupos foram sacrificados 3-4 horas após a última administração, durante o SE. Ao avaliar os hipocampos dos animais sacrificados 1.5-4 horas após o KA, foi possível observar uma diminuição significativa dos níveis proteicos de TrkB-FL e uma tendência para o aumento do rácio TrkB-ICD/TrkB-FL, o que sugere uma possível clivagem do TrkBFL nestes animais, quando comparados com os animais controlo. É importante ressalvar que, nos animais em SE foi possível observar um efeito positivo dos níveis proteicos de TrkB-ICD no número de crises nestes animais. No entanto, nos ratos com epilepsia estabelecida, não foi observado uma diminuição significativa nos níveis de TrkB-FL ou aumento da relação TrkB-ICD/TrkB-FL, sugerindo que essa clivagem pode não ocorrer durante a progressão da epilepsia. No entanto, pela limitação do número de animais, no futuro este número será aumentado e os animais serão segregados segundo a gravidade das crises, permitindo uma análise mais detalhada do papel da clivagem do TrkB-FL na epilepsia. Com base nos resultados obtidos, pode-se especular que a sinalização do BDNF/TrkB exerce um efeito epileptogénico nas fases iniciais desta doença, no entanto, não se perpetua durante a progressão da mesma. Quanto à análise de imunohistoquímica, foi observado um aumento da proliferação neuronal em animais mais jovens, independentemente da sua condição. No entanto, os animais com epilepsia estabelecida tendem a ter um volume maior do hipocampo, possivelmente relacionado com a dispersão das células granulares no Girus Dentado (DG). No futuro, a neurogénese deverá ser avaliada em diferentes pontos no tempo. Análises qualitativas de coloração de NeuN em animais com epilepsia estabelecida revelaram uma perda de imunoreactividade, sugestiva de neurodegeneração, e uma dispersão da camada granular do DG. Além disso, foi observada uma maior imunoreatividade à sinaptoporina no DG nestes animais, o que sugere a dispersão das fibras musgosas. Ao avaliar a modulação da clivagem do TrkB-FL usando o TAT-TrkB, foi possível observar que os animais tratados com KA apresentaram uma diminuição significativa nos níveis de proteína TrkB-FL, no entanto os animais injetados com TAT-TrkB 24 horas antes do KA não mostraram diferenças em comparação com os animais tratados com KA. Desta forma, o TAT-TrkB não foi capaz de prevenir a diminuição dos níveis de TrkBFL em animais com SE. A variabilidade entre os animais tratados com KA, que apresentam diferentes graus de gravidade das crises, o processo de degradação do TrkB-ICD, juntamente com o número baixo de animais, pode explicar a falta de diferenças nos níveis de proteína TrkBICD e na relação TrkB-ICD/TrkB-FL. Globalmente, este estudo oferece uma nova perspetiva sobre a fisiopatologia da epilepsia, ao sugerir que a clivagem do TrkB-FL contribui para a epileptogénese num modelo in vivo de epilepsia. Além disso, estabeleceu uma correlação entre o fragmento TrkB-ICD e a frequência de crises. Estes resultados são o primeiro passo para a identificação de novos alvos terapêuticos na epilepsia refratária.Epilepsy is characterized by a predisposition to generate recurrent spontaneous seizures. Alterations in brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and its tropomyosinrelated kinase B (TrkB) contribute to the pathophysiology of this disorder. It has been shown that TrkB-FL receptors are cleaved by calpains, originating a truncated receptor, TrkB-T’, and an intracellular fragment, TrkB-ICD. An in vitro model of status epilepticus (SE) suggested that TrkB-FL is cleaved in this context. Furthermore, a recent study revealed that TrB-ICD alters the expression of genes involved in epilepsy. However, the role of this cleavage in epilepsy remains unclear. The aims of this thesis were to understand the role of TrkB-FL cleavage and its modulation in an experimental in vivo model of epilepsy. Sprague-Dawley rats were injected with kainate (KA) to induce the experimental model of epilepsy. Animals were sacrificed 1.5-4 hours after KA (rats with SE) or 4 weeks after KA (rats with established epilepsy). TrkB-FL cleavage was assessed by western blot. To assess the impact of TrkB-FL cleavage inhibition, TAT-TrkB was injected 24h before KA, and animals were sacrificed during SE (in the first time-point). KA-treated animals presented a significant decrease in TrkB-FL levels when sacrificed during SE. Also, a tendency to increase the TrkB-ICD/TrkB-FL ratio was observed, suggesting a possible cleavage of TrkB-FL. Furthermore, in these epileptic animals there was a positive significant effect of TrkB-ICD levels on the number of seizures. KA-treated animals with established epilepsy showed a tendency to a decrease in the levels of TrkB-FL when compared with control. Moreover, these animals with spontaneous recurrent seizures displayed epileptic features such as neurodegeneration and mossy fiber sprouting, TAT-TrkB, a TrkB-FL cleavage inhibitor, was not able to prevent the decrease in TrkBFL levels in animals with SE. These results suggest that the cleavage of TrkB-FL plays a role in epileptogenesis in an in vivo model of epilepsy. These findings also suggest that TrkB-ICD might be involved in the development of SE. However, TAT-TrkB was not able to inhibit TrkB-FL cleavage in this model of epilepsy with treatment regimen.Xapelli, Sara AlvesRodrigues, Leonor RibeiroRepositório da Universidade de LisboaCorreia, Diana Sousa2023-062023-06-01T00:00:00Z2026-07-03T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/62861TID:203403266enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2025-03-17T15:11:51Zoai:repositorio.ulisboa.pt:10451/62861Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T03:36:24.821706Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse |
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