Validação de um método analítico para a determinação de antidepressivos em amostras de sangue por LC-MS/MS

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Main Author: Coelho, Maria João Vieira
Publication Date: 2023
Format: Master thesis
Language: por
Source: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
Download full: https://hdl.handle.net/10316/110609
Summary: Dissertação de Mestrado em Química Forense apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia
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spelling Validação de um método analítico para a determinação de antidepressivos em amostras de sangue por LC-MS/MSValidation of an analytical method for the determination of antidepressants in blood samples by LC-MS/MSAntidepressantsLC-MS/MSProtein precipitationBloodValidationAntidepressivosLC-MS/MSPrecipitação proteicaSangueValidaçãoDissertação de Mestrado em Química Forense apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaThe consumption of antidepressants (ADs) in the last decade has been increasing and, therefore, the request for their detection in biological samples in the Forensic Toxicology and Chemistry Service of the National Institute of Legal Medicine and Forensic Sciences is also increasing. For this reason, it is necessary to have a continuous scientific evolution of detection techniques and their validation in order to keep up with this growth. This work aimed to validate an analytical method for the simultaneous determination of 20 ADs (amitriptyline, bupropion, citalopram, clomipramine, dosulepin, duloxetine, fluoxetine, fluvoxamine, imipramine, maprotiline, mianserin, mirtazapine, paroxetine, reboxetine, sertraline, tianeptine, trazodone, trimipramine, venlafaxine and vortioxetine) and 11 of their metabolites. The analytical procedure for the determination of ADs in blood samples (100 μL) involved a protein precipitation (PP) and its subsequent analysis by liquid chromatography coupled to sequential mass spectrometry (LC-MS/MS) using electrospray ionization (ESI) as a source of ionization and detection by multiple reaction monitoring (MRM). In the chromatographic separation, an Acquity UPLC HSS T3 column (100 mm x 2.1 mm, 1.8 μm) was used and the mobile phase consisted of an aqueous solution of 2 mM ammonium formate (with 0.1 % formic acid) and methanol, in gradient mode, with a flow rate of 0.4 mL/min and an injection volume of 10 μL. The method was validated according to the Standard Practices for Method Validation in Forensic Toxicology by the American Academy of Forensic Science (AAFS) Standards Board (ASB) guidelines. Validation parameters studied included: study of interferences, ion suppresion, linearity, carryover, precision and accuracy, limits of detection and quantification, dilution integrity and stability. The method demonstrated the absence of interfering substances from other substances and from the internal standard, with the exception of maprotiline and nortriptyline, which proved to interfere with each other, particularly in the second ionic transition. The range of work chosen proved to be linear, considering a weighting factor of 1/x, always with a correlation coefficient greater than 0.99. No relevant carryover nor matrix effect was detected. The detection and quantification limits obtained are adequate taking into account the range of work studied. In the study of precision (intermediate precision and repeatability) and accuracy, the results obtained from the correlation coefficient (CV) were <20.0 %. For these substances, it was verified stability up to 72 h at room temperature and 1 week after a freezing process. The dilution integrity study demonstrated precision and accuracy at 1:5 (v/v) dilution. The analytical method described met all the necessary parameters according to the guidelines followed, so it can be concluded that it has been validated and allows the simultaneous determination and quantification of 20 ADs and 11 of its metabolites in blood samples by LC-MS/MS.O consumo dos antidepressivos (ADs) na última década tem vindo a aumentar e, portanto, a solicitação para a sua deteção em amostras biológicas no Serviço de Química e Toxicologia Forense, Delegação do Centro (SQTF-C) do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P. (INMLCF, I.P.) tem sido cada vez maior. Por este motivo, é necessário que haja uma contínua evolução científica de técnicas de deteção e a respetiva validação de forma a acompanhar este crescimento. Este trabalho teve como objetivo a validação de um método analítico para determinação simultânea de 20 ADs (amitriptilina, bupropiona, citalopram, clomipramina, dosulepina, duloxetina, fluoxetina, fluvoxamina, imipramina, maprotilina, mianserina, mirtazapina, paroxetina, reboxetina, sertralina, tianeptina, trazodona, trimipramina, venlafaxina e vortioxetina) e 11 dos seus metabolitos. O procedimento analítico para a determinação de ADs em amostras de sangue (100 μL) envolveu uma precipitação proteica (PP) e a sua posterior análise por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa sequencial (LC-MS/MS), usando Electrospray Ionization (ESI) como fonte de ionização e deteção por Multiple Reaction Monitoring (MRM). Na separação cromatográfica foi utilizada uma coluna Acquity UPLC HSS T3 (100 mm x 2,1 mm, 1,8 μm) e a fase móvel em gradiente, constituída por uma solução aquosa de formato de amónia 2 mM (com ácido fórmico 0,1 %) e metanol,com um fluxo de 0,4 mL/min e um volume de injeção de 10 μL. O método foi validado de acordo com as diretrizes da Standard Practices for Method Validation in Forensic Toxicology da American Academy of Forensic Science (AAFS) Standards Board (ASB). Os parâmetros de validação estudados incluíram: estudo das interferências, supressão iónica, linearidade, arrastamento, precisão e exatidão, limites de deteção e quantificação, integridade de diluição e estabilidade. O método demonstrou a ausência de interferentes por parte de outras substâncias e do padrãointerno, com exceção da maprotilina e nortriptilina que evidenciaram interferir entre si, em particularna segunda transição iónica. A gama de trabalho escolhida demonstrou ser linear, considerando um fator de ponderação de 1/x, sempre com um coeficiente de correlação superior a 0,99. Não foi detetado nenhum fenómeno de arrastamento ou efeito matriz relevante. Os limites de deteção e quantificação obtidos são adequados tendo em conta a gama de trabalho estudada. No estudo da precisão (precisão intermédia e repetibilidade) e da exatidão, os resultados obtidos de coeficiente de variação (CV) foram <20,0 %. Para estas substâncias medicamentosas verificou-se estabilidade até às 72 h a uma temperatura ambiente e 1 semana após um processo de congelação. O estudo da integridade de diluição demonstrou ter precisão e exatidão na diluição de 1:5 (v/v). O método analítico descrito cumpriu todos os parâmetros necessários segundo as diretrizes seguidas, pelo que se pode concluir que este foi validado e permite determinar e quantificar simultaneamente os 20 ADs e 11 dos seus metabolitos em amostras de sangue por LC-MS/MS.2023-09-18info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesishttps://hdl.handle.net/10316/110609https://hdl.handle.net/10316/110609TID:203400682porCoelho, Maria João Vieirainfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2023-11-23T23:05:42Zoai:estudogeral.uc.pt:10316/110609Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T06:02:35.451790Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse
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