Modulation of Retinal Ganglion Cell Function and Implications for Neuroprotection
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| Publication Date: | 2015 |
| Language: | eng |
| Source: | Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) |
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Summary: | Tese de doutoramento em Ciências da Saúde, no ramo de Ciências Biomédicas, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra |
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Modulation of Retinal Ganglion Cell Function and Implications for NeuroprotectionRetinaCélulas ganglionares da retinaTese de doutoramento em Ciências da Saúde, no ramo de Ciências Biomédicas, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de CoimbraO neuropeptídeo Y (NPY) é um neuromodulador no sistema nervoso central, capaz de exercer efeitos neuroprotetores. O NPY é expresso na retina de mamíferos mas a sua localização, e dos seus recetores, e o seu potencial efeito neuromodulador na retina continua pouco estudado. A morte das células ganglionares da retina (CGR) é uma das principais caraterísticas de doenças degenerativas da retina, particularmente do glaucoma. Neste trabalho, verficámos a presença de mRNA e immunoreatividade para o NPY e os recetores do NPY em preparações purificadas de CGR. Também avaliámos o efeito da ativação de recetores do NPY nos níveis intracelulares de cálcio livre – [Ca2+]i, e na formação de potenciais de ação, utilizando culturas purificadas de CGR e em preparações de retina ex vivo. Os potenciais de ação gerados pelas CGR foram registados com uma matriz de elétrodos. A aplicação de NPY atenuou o aumento da [Ca2+]i induzido por glutamato via ativação do recetor Y1. Além disso, a ativação dos recetores Y1/Y5 induziu um aumento da resposta inicial das CGR tipo-OFF após estimulação luminosa, embora não tenha alterado a atividade espontânea das CGR. A ativação dos recetores Y1 inibiu o aumento da formação de potenciais de ação pelas CGR após estimulação com N-metil-D-aspartato (NMDA). Estes resultados sugerem que a ativação dos recetores Y1, ao nível da camada plexiforme interna ou da camada plexiforme externa da retina modula as propriedades do campo recetivo das CGR. Ao expor explantes de retina in vitro a NMDA verificámos que o pré-tratamento com NPY foi capaz de prevenir a morte celular induzida pelo NMDA através da ativação dos recetores Y1 e Y5. Num modelo animal de isquémia-reperfusão, o pré-tratamento com NPY não preveniu a morte das CGR. Em resumo, identificámos efeitos modulatórios do NPY ao nível das CGR, em que a ativação dos recetores Y1 parece ter um papel central. Contudo, são necessários mais estudos com a finalidade de avaliar o potencial neuroprotetor do NPY in vivo em modelos de doenças degenerativas da retina. O sildenafil (ViagraTM) é um inibidor da fosfodiesterase tipo 5, amplamente usado no tratamento da disfunção erétil e na hipertensão arterial pulmonar. Alguns estudos clínicos reportaram deficiências visuais temporárias em doentes que utilizavam sildenafil, o que sugere o possível envolvimento das CGR, uma vez que são estas células que transmitem a informação visual para centros cerebrais responsáveis pelo processamento da visão. Contudo, o efeito do sildenafil nas respostas das CGR a estímulos luminosos está pouco esclarecido. Na segunda parte deste estudo, utilizámos uma matriz de elétrodos para avaliar o efeito do sildenafil nas respostas das CGR à luz em retinas ex vivo. Com perfusão constante, aplicámos concentrações crescentes de sildenafil (0,3 – 30 µM) durante períodos de 10 ou 60 minutos, seguidos de solução de lavagem. Uma concentração elevada de sildenafil (30 µM), provocou um decréscimo reversível na magnitude das respostas das CGR à luz, do tipo ON ou OFF das CGR, sendo que em 50% das CGR as respostas à luz foram completamente inibidas, embora reversivelmente. Além disso, o sildenafil provocou um aumento das latências das respostas do tipo ON e OFF. Também verificámos que a exposição prolongada a sildenafil, simultaneamente com estimulação luminosa, potencia os efeitos do fármaco e dificulta a recuperação das respostas das CGR à luz. Assim, concluímos que o registo da atividade das CGR com uma matriz de elétrodos em retinas ex vivo é um método eficiente para estudar o modo como as CGR poderão ser afetadas por diferentes fármacos. Esta avaliação é importante para o desenvolvimento de estratégias neuroprotetoras necessárias para o tratamento de doenças degenerativas da retina, nomeadamente o glaucoma, para o qual não existe um tratamento eficaz, capaz de impedir a morte das CGR.Neuropeptide Y (NPY) is a neuromodulator in central nervous system (CNS) that can exert neuroprotective effects. NPY is expressed in mammalian retina but the location and potential modulatory effects of NPY receptor activation remains largely unknown. Retinal ganglion cell (RGC) death is a hallmark of several retinal degenerative diseases, particularly glaucoma. In purified RGCs, we detected immunoreactivity and mRNA for NPY and NPY receptors in these cells. Using cultured purified RGCs and ex vivo retinal preparations we have evaluated the effect of NPY receptor activation on changes in RGC intracellular free calcium concentration – [Ca2+]i and RGC spiking activity. RGC spike recordings were performed by a multi-electrode array (MEA). We found that NPY application attenuated the increase in the [Ca2+]i triggered by glutamate in purified RGCs, possibly via Y1 receptor activation. Moreover, Y1/Y5 receptor activation increased the initial burst response of OFF-type RGCs, though no effect was observed in the RGC spontaneous spiking activity. The Y1 receptor activation was able to modulate directly RGC responses by attenuating the N-Methyl-D-aspartic acid (NMDA)-induced increase in RGC spiking activity. These results suggest that Y1 receptor activation at the level of inner or outer plexiform layers leads to modulation of RGC receptive field properties. Using in vitro culture of retinal explants exposed to NMDA, we found that NPY pre-treatment prevented NMDA-induced cell death through activation of Y1 and Y5 receptors. In an animal model of retinal ischemia-reperfusion (I-R) injury, pre-treatment with NPY was not able to prevent cell death or rescue RGCs. In summary, we found clear modulatory effects of NPY at the level of RGCs, and Y1 receptor appears to have a predominant role. However, further studies are needed to evaluate whether NPY neuroprotective action translates to in vivo models of retinal degenerative diseases. Sildenafil (ViagraTM), a cyclic guanosine monophosphate (cGMP)-specific phosphodiesterase type 5 inhibitor, is widely used for the treatment of erectile dysfunction and pulmonary arterial hypertension. Clinical studies reported transient visual impairments in patients after a single dose sildenafil ingestion, suggesting the implication of RGCs, since these cells convey visual information to the brain centres of visual processing. However, the effect of sildenafil on the RGC light responses is not fully understood. Using a MEA technique, in the second part of this study, we evaluated the effect of sildenafil on RGC light responses in ex vivo retinas. Under continuous perfusion, sildenafil citrate (0.3 to 30 µM) was applied to retinal preparations during 10 to 60 min followed by sildenafil washout. High concentration (30 µM) of sildenafil reversibly decreased the magnitudes of both ON- and OFF-type RGC light responses, and in 50% of RGCs, light responses were completely supressed. Sildenafil also greatly increased the latency of ON- and OFF-types of light responses. We provide the evidence that extended exposure to sildenafil and repeated light stimulation potentiates drug effects and delays recovery. In conclusion, we show that MEA recordings in ex vivo retinas might be a valuable method to understand how RGC circuitry can be affected by different drug treatments. This understanding is relevant to the development of neuroprotective strategies needed for retinal degenerative diseases, namely glaucoma, where no available treatment can effectively stop the progression of RGC death.FCT - SFRH/BD/44817/20082015-05-29doctoral thesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionMARTINS, João Filipe da Costa - Modulation of retinal ganglion cell function and implications for neuroprotection. Coimbra : [s.n.], 2015. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/26530https://hdl.handle.net/10316/26530MARTINS, João Filipe da Costa - Modulation of retinal ganglion cell function and implications for neuroprotection. Coimbra : [s.n.], 2015. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/26530https://hdl.handle.net/10316/26530TID:101286244engMartins, João Filipe da Costainfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2021-07-21T10:06:42Zoai:estudogeral.uc.pt:10316/26530Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T04:55:38.132279Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse |
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