Desenvolvimento de uma abordagem de ionização-dessorção a laser assistida por matriz acoplada a espetrometria de massa por tempo de voo para análise de biofilmes de Staphylococcus epidermidis formados in vitro

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Main Author: Lopes, Elísia G.
Publication Date: 2013
Format: Master thesis
Language: por
Source: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
Download full: http://hdl.handle.net/1822/28639
Summary: Dissertação de mestrado em Bioengenharia
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spelling Desenvolvimento de uma abordagem de ionização-dessorção a laser assistida por matriz acoplada a espetrometria de massa por tempo de voo para análise de biofilmes de Staphylococcus epidermidis formados in vitro579.61Dissertação de mestrado em BioengenhariaOs cateteres são a principal via de acesso venoso em pacientes que realizam hemodiálise (HD). Contudo, estes estão associados a elevadas taxas de mortalidade e morbilidade devido principalmente ao desenvolvimento de infeções. De facto, os cateteres facilitam o acesso ao sangue de microrganismos, em particular de Staphylococcus epidermidis, que possui a capacidade de aderir às superfícies do cateter e formar biofilme. O processo de formação de biofilme é multifatorial, podendo as proteínas intervenientes representar potenciais biomarcadores para o diagnóstico e monotorização terapêutica de infeções. Por conseguinte, o principal objetivo deste estudo consistiu na caracterização de biofilmes de S. epidermidis utilizando ionização/dessorção a laser assistida por matriz acoplada a espetrometria de massa por tempo de voo (MALDI-TOF MS). Inicialmente, foi realizada a pesquisa de microrganismos em cateteres de HD e investigada a capacidade de formação de biofilme in vitro de isolados clínicos de S. epidermidis. Adicionalmente, foi desenvolvida uma metodologia para a investigação do perfil proteico de sobrenadantes e das frações celulares (células de biofilme e planctónicas) de biofilmes de S. epidermidis formados in vitro, por MALDI-TOF MS. Este estudo revelou que a presença de microrganismos não é universal nos cateteres de HD. Contudo, S. epidermidis foi recuperado de cateteres e foi demonstrada a sua capacidade de formar biofilme in vitro. A análise por MALDI-TOF MS de sobrenadantes de biofilme mostrou que, nas condições testadas, não é possível obter espetros com qualidade, em termos do número de picos e de reprodutibilidade, invalidando a continuidade do seu estudo. Por outro lado, os estudos efetuados com frações celulares revelaram que os melhores espetros de MALDI-TOF MS, com maior número de picos detetados, se obtêm com: (1) a matriz ferulic acid (vs. a matriz α-cyano-4-hydroxycinnamic acid); (2) 2×108 UFC/posição da placa de MALDI-TOF MS (num intervalo de 2×106 a 6×108 UFC/posição); (3) com células intactas (vs. extratos celulares) lavadas e ressuspensas em ácido trifluoroacético. Apesar do método de MALDI-TOF MS ser rápido, simples e facilmente aplicável, a baixa reprodutibilidade observada neste estudo não permitiu a determinação de um perfil único, representativo e diferencial para cada fração celular. Em conclusão, este trabalho permitiu mostrar a importância da otimização de diferentes parâmetros experimentais nas análises de MALDI-TOF MS, sendo no entanto necessário o estudo de diferentes abordagens experimentais para a análise de biofilmes de S. epidermidis, antes de qualquer aplicação clínica desta técnica.Catheters are the most frequently used venous accesses in patients on hemodialysis (HD). However, these are associated with high rates of mortality and morbidity mainly due to the development of infections. In fact, catheters provide the access of microorganisms to the blood, particularly Staphylococcus epidermidis that has the ability to adhere to catheters surface and to form biofilms. The biofilm formation is a multifactorial process, and the proteins involved may represent potential biomarkers for diagnosis and therapeutic monitoring of infections. Therefore, the aim of this study was the characterization of S. epidermidis biofilms using matrix-assisted laser desorption/ionization - time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). Initially, the microbial population on HD catheters and the ability of clinical isolates of S. epidermidis to form biofilms in vitro was evaluated. Furthermore, it has been developed a methodology based on MALDI-TOF MS, to investigate the protein profile of supernatants and cellular fractions (biofilm and planktonic cells) of S. epidermidis biofilms formed in vitro. In this study, the analysis performed on catheters revealed that the presence of microorganisms is not universal in the HD catheters. However, S. epidermidis was recovered from catheters and it was demonstrated their ability to form biofilms in vitro. The MALDI-TOF MS analysis for biofilm supernatants showed that, under the tested conditions, it is not possible to obtain spectra with enough quality, regarding the number of peaks and the reproducibility, hampering their study. On the other hand, the studies concerning the cell fractions revealed that the best MALDI-TOF MS spectra, with higher number of peaks, are obtained with: (1) the ferulic acid matrix (vs. α-cyano-4-hydroxycinnamic acid matrix); (2) 2×108 CFU/MALDI-TOF MS plate position (in a range between 2×106 and 6×108 CFU/position); (3) with intact cells (vs. cell extracts) washed and resuspended in trifluoroacetic acid. Although the MALDI-TOF MS method was fast, simple and easily applicable, the low reproducibility observed in this study did not allow the determination of a unique, representative and differential profile for each cell fraction. In conclusion, this study revealed the importance of the optimization of several experimental parameters in MALDI-TOF MS analysis although it is necessary the study of different approaches for the analysis of S. epidermidis biofilms, before any clinical application of this technique.Martins, Margarida Isabel de Barros CoelhoUniversidade do MinhoLopes, Elísia G.20132013-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/1822/28639por201086778info:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2024-05-11T06:45:44Zoai:repositorium.sdum.uminho.pt:1822/28639Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-28T16:03:35.584910Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse
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