The role of RIPK3 in the crosstalk between hepatocytes and macrophages in metabolic-dysfunction associated steatotic liver disease

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Main Author: Alves, Mariana Isabel Francisco
Publication Date: 2023
Format: Master thesis
Language: eng
Source: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
Download full: http://hdl.handle.net/10451/63135
Summary: Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.
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spelling The role of RIPK3 in the crosstalk between hepatocytes and macrophages in metabolic-dysfunction associated steatotic liver diseaseNon-alcoholic fatty liver diseaseMetabolic-dysfunction associated steatotic liver diseaseRIPK3NecroptosisCell communicationTeses de mestrado - 2023Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.A doença hepática esteatótica associada a disfunção metabólica (DHEM), anteriormente conhecida como doença de fígado gordo não-alcoólico (FGNA), é a doença hepática crónica mais comum e é das principais causas de mortalidade e morbilidade hepática. Ainda assim, existe uma carência de terapias farmacológicas, o que suscita a necessidade de um melhor entendimento dos mecanismos da doença para identificar potenciais alvos terapêuticos. A proteína receptor-interacting protein kinase 3 (RIPK3) é um executor-chave da necroptose, uma forma de morte celular regulada imunogénica que está ativada na DHEM e que tem sido implicada na patogénese da doença. No entanto, o potencial benefício terapêutico resultante da inibição da RIPK3 continua a ser um assunto de debate, em parte devido à falta de estudos centrados na função da RIPK3 em diferentes tipos de célula. Neste trabalho, tivemos como objetivo compreender o papel da RIPK3, específico do tipo celular, na interação entre hepatócitos e macrófagos no contexto da DHEM. Foram realizadas co-culturas em monocamada e transwell in vitro de macrófagos J774A.1 e hepatócitos AML12 wild-type (WT) e deficientes em Ripk3, expostas ao ácido palmítico (AP). A morte celular e expressão de marcadores inflamatórios foram avaliados através de ensaios de citotoxicidade, qRT-PCR e imunoblotting. Os nossos resultados revelaram funções específicas da RIPK3 em cada tipo de célula. Em particular, em co-culturas de monocamada, hepatócitos WT pré-tratados com AP não ativaram os macrófagos, enquanto a deficiência de Ripk3 nos hepatócitos induziu uma resposta inflamatória nos macrófagos, evidenciada pelo aumento da expressão de marcadores pró-inflamatórios. Simultaneamente, a deficiência de Ripk3 nos hepatócitos aumentou de forma acentuada a expressão do marcador anti-inflamatório arginase-1 (Arg1), o que pode sugerir um papel da RIPK3 dos hepatócitos na mediação da polarização dos macrófagos para executar respostas de resolução de inflamação. Em concordância, a deficiência de Ripk3 nos hepatócitos protegeu-os da morte celular induzida por AP e as co-culturas com macrófagos contribuíram para a reparação de danos nos hepatócitos. Surpreendentemente, a redução de Ripk3 em macrófagos ativou-os para um fenótipo pró-inflamatório em condições basais, que foi exacerbado em macrófagos pré-estimulados com lipopolissacarídeo (LPS) e interferão-gama (IFN-γ). No entanto, a redução de Ripk3 em macrófagos também exacerbou a expressão de Arg1 em macrófagos co-cultivados com hepatócitos Ripk3-/- pré-tratados com AP. Além disso, os nossos resultados revelaram um papel específico da RIPK3 nos macrófagos na modulação do metabolismo dos hepatócitos, nomeadamente através do aumento de enzimas implicadas na produção de triglicerídeos e diminuição de enzimas da β-oxidação peroxissomal. Em suma, estes resultados fornecem novas informações sobre as funções da RIPK3 que podem influenciar a interação entre macrófagos e hepatócitos na DHEM. As diferentes funções da RIPK3 nos vários tipos de células devem ser consideradas no desenvolvimento de estratégias terapêuticas para a DHEM.Metabolic-dysfunction associated steatotic liver disease (MASLD), formerly known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the leading chronic liver disease worldwide and is the fastest-growing cause of liver mortality and morbidity. Still, there is a lack of pharmacological therapies, which calls for a better understanding of the underlying mechanisms to identify potential therapeutic targets. Receptor-interacting protein kinase 3 (RIPK3) is a key executor of necroptosis, an immunogenic form of regulated cell death activated in MASLD that has been implicated in disease pathogenesis. However, the potential therapeutic benefit resulting from RIPK3 inhibition remains a subject of debate, fueled, in part, by a lack of studies focusing on the cell-dependent contribution of RIPK3. Here, we aimed to understand the cell-specific role of RIPK3 and the crosstalk between hepatocytes and macrophages in the context of MASLD. In vitro monolayer and transwell co-cultures were performed using of wild-type (WT) and Ripk3-deficient AML12 hepatocytes and J774A.1 macrophages exposed to palmitic acid (PA). Cell death and inflammatory markers were evaluated through cytotoxicity assays, qRT-PCR, and immunoblotting. Our data showed RIPK3 cell-specific functions. Notably, in monolayer co-cultures, PA-pretreated WT hepatocytes failed to activate macrophages, while Ripk3 ablation in hepatocytes induced an inflammatory response, evidenced by an increase in pro-inflammatory markers in macrophages. Simultaneously, Ripk3 ablation in hepatocytes markedly increased anti-inflammatory arginase-1 (Arg1) expression, which may suggest a role of RIPK3 in hepatocytes in mediating macrophage polarization towards healing responses. In agreement, Ripk3 deletion in hepatocytes protected from PA-induced cell death and co-cultures with macrophages contributed to hepatocyte damage repair. Intriguingly, Ripk3 knockdown in macrophages promoted a pro-inflammatory phenotype in basal conditions, which was exacerbated in macrophages primed with lipopolysaccharide (LPS) plus interferon-gamma (IFN-γ). However, the knockdown of Ripk3 in macrophages also markedly upregulated Arg1 in macrophages co-cultured with PA-pretreated Ripk3-/- hepatocytes. Moreover, our results uncovered a macrophage-specific role of RIPK3 in modulating hepatocyte metabolism, namely through the upregulation and downregulation of enzymes implicated in triglyceride production and peroxisomal β-oxidation, respectively. Altogether, these findings provide novel information about unexpected roles of RIPK3 that could modulate the interplay between macrophages and hepatocytes in MASLD. These intricacies should be considered when evaluating RIPK3 as a therapeutic target for MASLD.Research Institute for Medicines (iMed.ULisboa).Afonso, Marta BentoRodrigues, Cecília Maria PereiraRepositório da Universidade de LisboaAlves, Mariana Isabel Francisco2023-12-122023-11-302026-12-12T00:00:00Z2023-12-12T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/63135TID:203458095enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2025-03-17T15:12:27Zoai:repositorio.ulisboa.pt:10451/63135Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T03:36:38.475721Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse
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