Role of histone H1 in chromatin and gene expression in the african trypanosome : broad skills, specific functions?

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Main Author: Pena, Ana Catarina Dias, 1985-
Publication Date: 2015
Language: eng
Source: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
Download full: http://hdl.handle.net/10451/22731
Summary: Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Microbiologia e Parasitologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2015
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spelling Role of histone H1 in chromatin and gene expression in the african trypanosome : broad skills, specific functions?HistonasTrypanosoma bruceiCromatinaExpressão génicaTeses de doutoramento - 2015Domínio/Área Científica::Ciências Médicas::Medicina BásicaTese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Microbiologia e Parasitologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2015Trypanosoma brucei is a unicellular protozoan parasite that lives in the bloodstream and interstitial spaces of a mammalian host and that is transmitted by the tsetse, an insect vector. In humans, it causes sleeping sickness. T. brucei has a complex life cycle that progresses through different developmental stages. Inside the mammal, the parasite lives as bloodstream forms (BSFs), which differentiates differentiates into procyclic forms (PFs) upon transmission to the insect vector. T. brucei is an evolutionarily early-branching organism that possesses many unusual features for an eukaryote. Most of its transcription is constitutive and driven by RNA polymerase II (Pol II) and RNA polymerase I (Pol I) transcribes not only ribosomal RNA genes, but also protein-coding genes, including genes encoding variant surface glycoproteins (VSGs) and procyclins. These are highly abundant proteins that cover the surface of the BSFs and the PFs, respectively, and whose expression is tightly developmentally regulated. In BSFs, VSGs are transcribed in subtelomeric bloodstream expression sites (BESs). There are ~15 BESs in the genome, however only one is fully transcriptionally active at a time. The remaining BESs need to be kept silent to maintain monoallelic expression of BES. To evade the host immune system, parasites switch the expressed VSG from time to time by a mechanism called antigenic variation. In addition, in BSFs procyclin loci are also partially repressed to prevent illegitimate VSG replacement for procyclins. Some epigenetic factors have been found to regulate Pol I transcriptional activation/silencing at BESs and procyclin loci. Besides, a number of histone variants and histone modifications seem to be associated with Pol II transcription initiation and termination. Inside the eukaryotic nucleus, DNA is wrapped around an octamer of histones that forms the nucleosome, the basic unit of chromatin. Linker histone or histone H1 (H1) binds to the DNA entering and exiting the nucleosome, stabilizing its structure and contributing to the establishment of higher-order chromatin structures. In T. brucei, H1 is encoded by at least five genes and, based on the predicted protein sequence, they can be split in three classes. In my PhD work I aimed at analyzing the roles of H1 in chromatin structure, genome-wide gene expression and transcription in T. brucei. In addition, the importance of H1 for T. brucei mammalian infections in vivo was also addressed. Functional studies were performed by simultaneously depleting all classes of H1 by RNA interference (RNAi). Using chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone H3 and formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE), in H1-depleted parasites we detected a global chromatin opening across the genome, even though this happened at silent BESs promoters more prominently and procyclin loci, to a lesser extent. Curiously, RNA sequencing (RNA-Seq) revealed that global chromatin opening due to H1 depletion is not associated with widespread alterations in gene expression but rather with derepression of a specific subset of genes. Out of ~9,000 genes, only 26 were significantly upregulated, mostly from silent BESs (including silent VSGs) and procyclin loci genes. I adapted and used 4-thiouridine (4sU) metabolic labeling of RNA in T. brucei to purify and quantify nascent transcripts emanating from Pol I and Pol II-transcribed loci. 4sU-labeling has the advantage over classical nuclear run-on of measuring transcription de novo in unperturbed cells. Quantification of 4sU-labeled nascent RNA showed that H1 is necessary to repress Pol I transcription at silent BESs and procyclin loci but apparently not at Pol II genes. Altogether our data strongly supports a model in which H1 induces global chromatin compaction, but in what concerns gene expression, H1 plays more specific functions, namely on transcriptional regulation of silent Pol I transcribed genes. This is consistent with the long-stand notion that polycistronic transcription by Pol II is constitutive and most genes are controlled essentially at the post-transcriptional level. On the other hand, Pol I genes are known to be regulated at the transcriptional level, consistent with a role of H1 in silencing Pol I transcription initiation/elongation. An additional phenotype observed in H1-depleted parasites was its increased resistance to methyl methanoesulfonate (MMS)-induced DNA damage. This might indicate that H1 also plays a more general role such as suppressing homologous recombination and perhaps genomic instability. Interestingly, H1-depleted T. brucei parasites revealed an apparent loss-of-fitness during in vivo infections. In mice infected with H1-depleted parasites, progression of parasitaemia (percentage of parasites in the blood) was delayed and mice succumbed later in infection. Curiously, this phenotype was completely abolished in highly immune-compromised mice that lack T, B and NK lymphocytes, demonstrating that fitness of H1-depleted parasites inside the host is impaired because, somehow, these parasites are more susceptible to host immune system. Altogether our results show that H1 of the early divergent T. brucei has ‘broad skills’ because it compacts chromatin throughout the genome, but it plays ‘specific functions’ at the transcription level because it represses transcription of a limited cohort of genes, namely silent Pol I loci. H1-mediated regulation of a specific set of genes was also observed in other higher and lower eukaryotes, which suggests that despite being the most divergent family of histones, its functions were conserved throughout evolution.O Trypanosoma brucei é um protozoário unicelular que vive na corrente sanguínea e espaços intersticiais de um hospedeiro mamífero e que é transmitido pela mosca tsétsé, o seu vetor de transmissão. Em humanos, o T. brucei causa a doença do sono. O T brucei tem um ciclo de vida complexo no qual o parasita passa por vários estadios de desenvolvimento. Dentro do mamífero, o parasita vive sob a forma de tripomastigotas sanguíneos (bloodstream forms; BSFs), e após ser transmitido para a mosca tsé-tsé, diferencia-se em tripomastigotas procíclicos (procyclic forms; PFs). O parasita T. brucei é um organismo que divergiu cedo na evolução e que possui muitas características pouco usuais para um eucariota. A sua transcrição é maioritariamente constitutiva e executada pela RNA polimerase II (Pol II)., enquanto que a RNA polimerase I (Pol I) transcreve não só os RNAs ribossomais, mas também genes codificantes de proteínas. Entre os genes transcritos por Pol I encontram-se os genes que codificam as glicoproteínas variantes de superfície (variant surface glycoproteins; VSGs) e as prociclinas. As VSGs e as prociclinas são proteínas muito abundantes que revestem a superfície dos BSFs e dos PFs, respetivamente, e cuja expressão é estritamente regulada ao longo do desenvolvimento do parasita. Nos BFSs, os genes das VSGs são transcritos em locais de expressão subteloméricos (bloodstream expression sites; BESs). Existem cerca de 15 BESs no genoma, contudo apenas um está transcricionalmente ativo em determinado momento. Os restantes BESs necessitam de ser mantidos silenciados por forma a manter a expressão monoalélica de um único BES. Para evitar o reconhecimento pelo sistema imunitário do hospedeiro, periodicamente os parasitas mudam o gene VSG expresso, através de um mecanismo denominado de variação antigénica. Nos BSFs o loci das prociclinas também está parcialmente reprimido por forma a evitar a substituição das VSGs por prociclinas à superfície. Existem evidências de que em T. brucei alguns fatores epigenéticos regulam a ativação ou o silenciamento transcricional de Pol I nos BESs e loci das prociclinas. Para além disso, existem algumas variantes de histonas e modificações pós-traducionais de histonas que estão associadas com os locais de iniciação e terminação da transcrição por Pol II. No núcleo de células eucarióticas o DNA encontra-se enrolado em volta de um octâmero de histonas formando o nucleosoma, a unidade básica da cromatina. A histona H1 (H1) liga-se ao DNA que entra e sai do nucleosoma, estabilizando a sua estrutura e contribuindo para o estabelecimento de estruturas de cromatina de ordem mais elevada. Em T. brucei a H1 é codificada por pelo menos 5 genes que, de acordo com a sua sequência proteica esperada, podem agrupar-se em 3 classes. No meu trabalho de doutoramento, tive por objetivo investigar as funções da H1 na estrutura da cromatina, na expressão génica e na transcrição de T. brucei. Para além disso, também foi estudada a importância da H1 nas infeções in vivo de T. brucei no hospedeiro mamífero. Foram realizados estudos funcionais em que se depletaram todas as classes de H1 por RNA de interferência (RNAi). Na presença de tetraciclina, RNAs de dupla-cadeia são produzidos que induzem a depleção dos RNAs mensageiros (mRNAs) de H1. Usando imunoprecipitação de chromatina (chromatin immunoprecipitation; ChIP) associada a histona H3 e formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE), detetou-se uma descondensação global de cromatina ao longo do genoma nos parasitas depletados de H1. No entanto, esta descondensação foi mais proeminente nos promotores de BES silenciados e nos loci de prociclinas, apesar de mais ligeiramente nestes últimos. Curiosamente, a sequenciação de RNA (RNA-Seq) revelou que a abertura global da cromatina devida à depleção de H1 não estava associada a alterações generalizadas de expressão génica mas pelo contrário à desrepressão de um subgrupo específico de genes. De cerca de 9000 genes, apenas 26 passarm a ser significativamente sobreexpressos, maioritariamente genes de BESs silenciados (inclusive VSGs silenciados) e genes de loci de prociclinas. Eu adaptei e apliquei a marcação metabólica de RNA com 4-tiouridina (4sU) em T. brucei para purificar e quantificar os transcritos nascentes produzidos nos loci transcritos por Pol I e Pol II. A marcação com 4sU traz vantagens em relação à técnica classicamente utilizada de nuclear run–on, por permitir a medição da transcrição de novo em células não perturbadas. A quantificação de RNA nascente marcado com 4sU demonstrou que a H1 é necessária para reprimir a transcrição de Pol I nos BESs silenciados e nos loci de prociclinas, mas aparentemente não o é para os genes transcritos por Pol II. No seu conjunto, os nossos resultados suportam um modelo em que a H1 induz a compactação global de cromatina, mas desempenha funções mais específicas no que respeita à expressão génica, nomeadamente a regulação transcricional de genes silenciados de Pol I. Este modelo é consistente com a noção de que a transcrição policistrónica por Pol II, que ocorre na maior parte do genoma de tripanossomas, é constitutiva e a maioria dos genes são controlados ao nível pós-transcricional. Pelo contrário, existem evidências de que os genes transcritos por Pol I são regulados ao nível transcricional, consistente com a função da H1 no silenciamento da iniciação/elongamento da transcrição por Pol I. Outro fenótipo observado em parasitas depletados de H1 foi um aumento da resistência a danos no DNA induzidos por metanossulfonato de metilo (MMS). Esta observação poderá indicar que a H1 desempenha funções mais gerais ao suprimir a recombinação homóloga e, talvez, a instabilidade genómica. Interessantemente, os parasitas de T. brucei depletados em H1 revelaram uma aparente perda de fitness durante infeções in vivo. Em murganhos infetados com parasitas depletados em H1, a progressão da parasitémia (percentagem de parasitas no sangue) foi mais lenta e os murganhos sucumbiram mais tarde. Curiosamente, este fenótipo foi completamente abolido em murganhos severamente imuno-comprometidos que não possuem linfócitos T, B e NK, demonstrando que a fitness de parasitas depletados em H1 é perturbada porque, de alguma forma, estes parasitas tornam-se mais suscetíveis ao sistema imunitário do hospedeiro. Coletivamente os nossos resultados mostram que a H1 de T. brucei, um parasita que divergiu cedo na evolução, tem capacidades abrangentes porque é necessária para compactar a cromatina globalmente ao longo do genoma, mas em termos de transcrição desempenha funções específicas porque inibe a transcrição de um grupo restrito de genes, nomeadamente de loci silenciados transcritos por Pol I. A regulação de um grupo específio de genes mediada por H1 foi também observada noutros eucariotas superiores e inferiores, o que sugere que apesar de ser a família mais divergente de histonas, as suas funções foram conservadas ao longo da evolução.Figueiredo, Luísa MirandaJanzen, ChristianRepositório da Universidade de LisboaPena, Ana Catarina Dias, 1985-2017-12-09T01:30:10Z201520152015-01-01T00:00:00Zdoctoral thesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/22731TID:101368445enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2025-03-17T13:26:27Zoai:repositorio.ulisboa.pt:10451/22731Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T02:44:42.287147Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse
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