Apoptosis signaling associated with amyloid β-induced cellular dysfunction and degeneration : relevance for Alzheimer’s disease
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| Source: | Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) |
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Summary: | Tese de Doutoramento em Farmácia (Bioquímica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2011 |
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Apoptosis signaling associated with amyloid β-induced cellular dysfunction and degeneration : relevance for Alzheimer’s diseaseTeses de doutoramento - 2011Tese de Doutoramento em Farmácia (Bioquímica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2011A doença de Alzheimer (AD) é uma doença neurodegenerativa devastadora, de causa ainda desconhecida e para a qual não existe cura. Afecta principalmente pessoas idosas e, com o aumento gradual da esperança média de vida, tornou-se um dos mais graves problemas de saúde pública. O período médio de sobrevivência do indivíduo doente, após o diagnóstico, é de apenas 8 anos. Caracteriza-se por originar uma perda progressiva da memória e da capacidade de raciocínio, mudanças de humor, mudanças de personalidade e perda de independência. As mutações responsáveis por AD e pelas formas familiares da doença representam apenas 5% do total de casos. Embora raras, essas mutações estão muito bem estudadas e definidas. As primeiras mutações que foram identificadas situam-se no gene da proteína precursora do péptido β amilóide (Aβ), o qual se localiza no cromossoma 21. As formas mutantes do Aβ, ao contrário da sua forma nativa, têm a particularidade de serem bastante agressivas para as células endoteliais vasculares do cérebro, originando a chamada angiopatia amilóide cerebral. Em termos fisiopatológicos, a AD caracteriza-se, ainda, pela perda massiva de neurónios, o que origina perturbações na função sináptica. Esta perda de neurónios começa no hipocampo, numa área que desempenha uma função primordial na formação de novas memórias, e rapidamente atinge outras zonas do cérebro. As placas amilóides e as tranças neurofibrilhares, resultantes da hiperfosforilação da proteína tau, são os únicos elementos discriminadores da doença, utilizados para realizar o seu diagnóstico definitivo aquando da autópsia. Estudar e compreender o fenómeno da morte celular programada é de todo imperativo. A apoptose é um processo altamente regulado, que envolve vários organitos e, como tal, pode ser iniciado em diversos locais da célula. Na realidade, cada organito possui sensores que lhes permitem aferir a homeostasia dos processos bioquímicos que regula. Sempre que a homeostasia esteja comprometida, de uma forma que coloque em risco a sobrevivência da célula, os organitos comunicam sinais de morte celular entre si, para que a célula seja removida, sem comprometer as células adjacentes. Assim, a descodificação da complexa rede de sinalização intracelular, responsável pela morte celular programada do tipo apoptótico, pode representar a chave para retardar, ou até prevenir, a neurodegenerescência associada à AD. O conceito de que a morte celular não é meramente aleatória e caótica, mas antes pode seguir um processo programado e regulado, representou um estímulo para desenvolver o trabalho apresentado nesta tese. Resumo viii Sabendo que a aplicação aguda de formas solúveis do péptido Aβ mimetiza a toxicidade observada na AD, estudaram-se os efeitos do Aβ na morte celular. Inicialmente, procurámos entender o papel da agregação do Aβ na morte celular e, para isso, tirámos partido do facto de os péptidos mutantes de Aβ terem características particulares de agregação, para além de uma afinidade selectiva para as células vasculares. Assim, usando células primárias de endotélio vascular humano, determinámos que o péptido mutante AβE22Q apresenta um estado conformacional intermédio, entre o observado para a formas nativas de Aβ40 e Aβ42. Além disso, mostrámos que, ao contrário das formas nativas, o péptido mutante AβE22Q activa a apoptose nestas células através da translocação da Bax para a mitocôndria, com a consequente libertação do citocromo c para o citosol. Este efeito conseguiu ser revertido com a pré-incubação das células com um agente anti-apoptótico, o ácido tauro-ursodesoxicólico (TUDCA). Contudo, apesar do seu potente efeito anti-apoptótico, o TUDCA não interferiu directamente com as propriedades de agregação características do Aβ in vitro. Estes resultados demonstram que a agregação, por si só, não é suficiente para induzir toxicidade. Sugerem, antes, que os efeitos tóxicos são devidos a conformações específicas que os péptidos adquirem e que estas, sim, conseguem danificar a célula e despoletar a via mitocondrial de apoptose. Tendo em conta que durante o processo de agregação do péptido Aβ, este forma espécies desnaturadas e que o retículo endoplasmático (ER) é o organito responsável pela conformação espacial das proteínas, estudámos em que medida o Aβ solúvel afecta o ER. A exposição de células PC12 do tipo neuronal ao Aβ provocou uma resposta imediata de sinalização molecular, que envolveu a caspase-12, independentemente da activação da via do stresse do ER e que culminou na morte celular. Assim, observaram-se níveis proteicos diminuídos dos marcadores de stresse do ER, incluindo o GRP94, ATF-6α, CHOP e eIF2α. Este efeito mostrou-se independente de mecanismos de degradação proteica, mediados pelo protessoma ou pela autofagia, tendo sido parcialmente contrariado pelo TUDCA. Por sua vez, com a inibição das calpaínas conseguiu-se bloquear a activação da caspase-12 e a diminuição do ATF-6α. Muito interessante foi, ainda, o facto de ser possível bloquear a diminuição dos níveis da proteína GRP94 através da inibição da via secretória de proteínas, pela utilização da geldanamicina e brefeldina. Este mecanismo de sinalização pelo péptido Aβ coloca o GRP94 no meio extracelular, abrindo uma oportunidade única para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Resumo ix Para finalizar, tendo em conta que a cinase do terminal amínico da proteína c-Jun (JNK) é um sensor primordial do stresse celular, activado na presença do Aβ, bem como o facto de a JNK activar a caspase-12 e poder ser activada por vias despoletadas no ER, realizámos estudos para compreender o envolvimento desta cinase no contexto de exposição de células PC12 do tipo neuronal ao péptido Aβ solúvel. Os nossos resultados mostraram que a JNK é indispensável à apoptose induzida pelo Aβ e que está localizada no núcleo, no seu pico de actividade. Além disso, através do silenciamento da JNK, confirmámos que a caspase-2 é um alvo específico da JNK, quando activada pelo Aβ. Demonstrámos, ainda, que a caspase-2 activa está localizada no complexo de Golgi, através da clivagem do seu substrato específico, a golgina 160, que é uma proteína estrutural do complexo de Golgi. Através da pré-incubação com TUDCA, conseguiu-se, também aqui, reverter a activação da JNK e a sua translocação para o núcleo, tendo sido ainda possível reverter a activação da caspase-2. Estes resultados sugerem que o complexo de Golgi possa desempenhar um papel fundamental na descodificação da sinalização de morte induzida pelo péptido Aβ. Os estudos incluídos nesta tese enfatizam a noção de que a AD é uma patologia complexa, que envolve uma rede de sinalização entre vários organitos celulares, para além de contribuirem para uma melhor compreensão da comunicação subcelular, no que respeita aos efeitos tóxicos desencadeados pelo Aβ. A caracterização destas vias de sinalização e de formas de as modular, abrem novas perspectivas para a regulação da disfunção celular e degenerescência induzidas pelo Aβ.(SFRH/BD/30467/2006) Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), Lisbon, Portugal; PTDC/BIA-BCM/67922/2006 and PTDC/SAU-FCF/67912/2006 from FCT and FEDER.Rodrigues, Cecília Maria Pereira, 1968-Repositório da Universidade de LisboaViana, Ricardo Jorge Soares, 1980-2011-03-28T13:28:01Z20102010-01-01T00:00:00Zdoctoral thesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/2832porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2025-03-17T12:42:53Zoai:repositorio.ulisboa.pt:10451/2832Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T02:26:22.065012Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse |
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