Regulation of protein-coding gene expression by promoter-proximal convergent antisense transcription
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| Publication Date: | 2022 |
| Format: | Master thesis |
| Language: | eng |
| Source: | Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) |
| Download full: | http://hdl.handle.net/10451/56902 |
Summary: | Tese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências |
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Regulation of protein-coding gene expression by promoter-proximal convergent antisense transcriptionRegulação da expressão genéticalncRNAsZEB2-NATZEB2Teses de mestrado - 2023Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasHigh-throughput sequencing technologies have shown that eukaryotic cells produce numerous noncoding transcripts. Among these are long non-coding RNAs (lncRNAs), defined as transcripts of more than 200 nucleotides that do not belong to any other well-defined group of non-coding RNAs. A particular class of lncRNAs overlaps protein-coding (PC) genes and are transcribed from the opposite strand, being known as natural antisense transcripts (NATs). A specific subgroup of NATs that overlap the promoter region of the PC genes with convergent transcription ending upstream of the PC gene transcription start sites were called promoter-proximal convergent antisense transcripts (PCATs). Studies on the transcriptional pair PC/PCAT, ZEB2/ZEB2- NAT, revealed that reducing ZEB2-NAT RNA levels results in the downregulation of ZEB2 transcripts. While this study highlights the physiological role of ZEB2-NAT in ZEB2 protein-encoding gene expression, the mechanism by which this occurs is not understood. The goal of this project was to test the hypothesis that ZEB2-NAT enhances the transcription of the overlapping PC gene ZEB2 and to dissect the mechanisms by which this PCAT regulates ZEB2 transcription, using human induced pluripotent stem cells as the study model. Previous results have shown that ZEB2-NAT transcripts are up regulated when iPSCs shift from self-renewal to lineage commitment before the level of ZEB2 increases. iPSCs were manipulated to up-regulate and downregulate ZEB2-NAT RNA levels to assess the outcome on transcription of the ZEB2 gene by RT-qPCR. The up regulation was performed with two approaches: transient transfection of a cloned ZEB2-NAT gene (cis-acting mechanism) and activation of the endogenous promoters using CRISPR-SAM (trans-acting mechanism). The downregulation of ZEB2-NAT was made with antisense LNA GapmeRs. The exogenous expression of ZEB2-NAT RNA either in iPSCs or during early mesoderm commitment did not increase ZEB2 mRNA levels. However, the activation of the endogenous ZEB2-NAT expression using CRISPR-SAM was able to induce the expression of ZEB2, but only in iPSCs and not during early mesoderm commitment. The antisense LNA GapmeRs against ZEB2-NAT RNA did not accomplish a significative reduction of its levels, precluding an effect on ZEB2 gene expression. Taken together the results obtained support the hypothesis that ZEB2-NAT function by enhancing the expression of the overlapping protein-coding gene ZEB2 and suggest this is mediated by a cis-acting mechanism.A sequenciação de RNA em larga escala veio demonstrar que embora a grande maioria do genoma seja transcrito, apenas cerca de 2% corresponde a RNA mensageiro com potencial para codificar proteínas. Atualmente sabe-se que a restante parte do genoma, não codificante de proteínas, desempenha uma função significativa na regulação da expressão de genes codificantes de proteínas (PC). Entre os transcritos não codificantes estão os RNAs longos não codificantes (lncRNAs), que são definidos como transcritos que possuem mais de 200 nucleótidos e que não pertencem a nenhum outro grupo bem definido de RNAs não codificantes. Estes têm sido implicados numa vasta gama de processos celulares, incluindo a regulação transcricional, a diferenciação e a reprogramação celular, no entanto a função da grande maioria dos lncRNAs é ainda desconhecida. Os lncRNAs partilham uma semelhança estrutural com os RNAs mensageiros no sentido em que ambos passam por etapas de processamento semelhantes que incluem a adição de uma guanosina metilada à extremidade 5’, o splicing de intrões, e a adição de uma cauda de poli(A) á extremidade 3’. Geralmente os lncRNAs são classificados de acordo com a sua localização no genoma e orientação em relação a um gene codificante ou não codificante de proteínas. Os lncRNAs podem ser considerados intergénicos quando se encontram localizados entre dois genes PC, bidirecionais quando estes são transcritos bidireccionalmente, e podem também sobrepor com genes PC de forma sense, possuindo a mesma orientação de transcrição que os genes PC, ou de forma antisense. Quando os lncRNAs sobrepõem com genes PC de forma antisense são chamados de transcritos antisense naturais (NATs) que podem ser classificados de acordo com a sua posição relativa ao gene codificante ou não-codificante de proteínas em três categorias distintas: frente a frente, quando a transcrição do sense e antisense se sobrepõem nas extremidades 5'; cauda a cauda, quando a transcrição do sense e antisense se sobrepõem nas extremidades 3'; e sobreposição total, quando uma transcrição é totalmente sobreposta à outra. Atualmente , sabe-se que os NATs podem ter funções reguladoras e contribuir para múltiplos processos que regulam a expressão genética. Enquanto os NATs citoplasmáticos normalmente regulam a estabilidade do RNA ou a tradução do RNA mensageiro, os NATs nucleares estão principalmente envolvidos em modificações epigenéticas, na interferência transcricional, no splicing alternativo, ou no processamento de RNA. Os NATs envolvidos em modificações epigenéticas levam à regulação dos níveis de expressão dos genes PC através da regulação de modificações da cromatina. Uma das formas de modificar a transcrição de genes da cadeia sense dá-se quando os lncRNAs interferem e suprimem, por mecanismos de ação cis, a transcrição destes mesmos genes. Por sua vez, a edição do RNA é um mecanismo pós-transcricional que envolve modificações de nucleótidos específicos numa sequência de RNA, que é realizada por enzimas reguladoras responsáveis pela alteração de adenosina em inosina em moléculas de RNA de cadeia dupla, tais como as que são formadas por NATs com RNA transcritos das respetivas cadeias sense. Por fim, os NATs possuem também a capacidade de regular a expressão génica através da formação de complexos de NATs com sequências sobrepostas a um gene PC que se encontra na cadeia sense, onde esta molécula de cadeia dupla de RNA fornece uma barreira física contra fatores de regulação pós-transcrição ao gene PC, interferindo com o splicing, ao mascarar os locais onde este ocorre, ou ainda interferindo com a tradução do gene. Estudos sobre o par transcricional PC e PCAT, ZEB2 e ZEB2-NAT, em linhas celulares de ratinho, revelaram que a redução dos níveis de RNA ZEB2-NAT resulta na diminuição dos transcritos de ZEB2. A proteína ZEB2 (Zinc finger E-box Binding homeobox 2) é um fator de transcrição que é responsável pela diminuição da expressão de E-caderina, sendo crucial no processo de transição celular epitelialmesenquimal (EMT), que ocorre geralmente durante o desenvolvimento e em processos tumorigénicos. Com o crescente desenvolvimento da área dos lncRNAs, nomeadamente dos NATs, outros pares de genes PC e os respetivos NATs com semelhanças ao par ZEB2 e ZEB2-NAT foram descritos, sugerindo assim a existência de um mecanismo de regulação de genes PC que é realizado pelos NATs. O laboratório anfitrião tem-se concentrado num subgrupo específico de NATs que sobrepõem a região promotora dos genes PC com transcrição convergente que termina a montante do local de início da transcrição de genes PC. Estes foram chamados de transcritos convergentes antisense próximos do promotor (promoter-proximal convergent antisense transcripts or PCATs). Embora este estudo destaque o papel fisiológico do ZEB2-NAT na expressão do gene codificante de proteínas ZEB2, o mecanismo pelo qual isto ocorre não é totalmente compreendido. Assim, este projeto visa testar a hipótese de que o ZEB2-NAT funciona de forma a estimular a transcrição do gene PC sobreposto, o ZEB2 e dissecar o mecanismo pelo qual este PCAT regula a transcrição de ZEB2. As células estaminais pluripotentes induzidas humanas foram utilizadas como modelo de estudo, uma vez que resultados preliminares mostram que os níveis de RNA ZEB2-NAT aumentam quando as iPSCs passam de um processo de autorrenovação para um estado de diferenciação, e que isto precede o aumento nos níveis de mRNA de ZEB2. Como tal as iPSCs foram manipuladas tanto para aumentar como para diminuir a expressão de ZEB2-NAT e posteriormente avaliar o resultado sobre a transcrição do gene ZEB2 através RT-qPCR. O aumento da expressão de ZEB2-NAT foi realizado com duas abordagens distintas: a transfeção transitória do gene ZEB2-NAT clonado num vetor de expressão, para testar se atua por um mecanismo em cis; e a ativação de promotores endógenos utilizando a ferramenta biotecnológica CRISPR-SAM, para verificar se é um mecanismo trans, onde a transcrição antisense exerce os seus efeitos através das moléculas de RNA transcritas ou através da sua interação com outros loci através da organização tridimensional da cromatina. A diminuição do PCAT ZEB2-NAT foi realizada com recurso a LNA GapmeRs antisense. Quando realizadas as transfeções com o vetor contendo o gene clonado ZEB2-NAT, estas falharam no aumento os níveis de mRNA de ZEB2 quer em iPSCs, quer durante o início da diferenciação em mesoderme. Por sua vez, ao ativar a expressão endógena de ZEB2-NAT com recurso á técnica de CRISPR-SAM, em iPSCs ocorreu um aumento da expressão de mRNA de ZEB2. Ainda assim, o mesmo não se verificou quando se ativou a expressão endógena de ZEB2-NAT durante o início da diferenciação da mesoderme. Quanto á diminuição da expressão de ZEB2-NAT com recurso aos GapmeRs LNA antisense contra os transcritos de ZEB2-NAT que foram utilizados por um processo denominado de gimnose. No entanto estes não conseguiram alcançar uma redução significativa dos níveis de ZEB2-NAT, impossibilitando assim a avaliação do seu efeito sobre a expressão do gene ZEB2. No seu conjunto, os resultados aqui obtidos confirmam que os genes ZEB2-NAT e ZEB2 têm uma correlação positiva e sugerem que o mecanismo de regulação funciona de forma cis, ainda que sejam necessárias outras abordagens experimentais para compreender como exatamente, o PCAT ZEB2-NAT interage e regula a transcrição do gene PC ZEB2. Desta forma, poder dissecar o mecanismo exato de como o ZEB2-NAT regula a transcrição de ZEB2 permite uma melhor compreensão de como os PCATs podem regular a expressão genética do gene PC correspondente, de forma a permitir que, potencialmente, a modulação dos PCAT seja utilizada como uma ferramenta biotecnológica no futuro.Custódio, Noélia Maria FernandesFigueiredo, Andreia Cristina Silva Viegas MataRepositório da Universidade de LisboaDias, Inês Gonçalves202320222025-10-30T00:00:00Z2023-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/56902TID:203492480enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2025-03-17T14:55:39Zoai:repositorio.ulisboa.pt:10451/56902Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T03:29:08.473661Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse |
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