Production and Characterization of Recombinant AlphaSynuclein Protein Species
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|---|---|
| Data de Publicação: | 2023 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/63922 |
Resumo: | Tese de mestrado, Bioquímica e Biomedicina , 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências |
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Production and Characterization of Recombinant AlphaSynuclein Protein Speciesalfa-sinucleínadoença de Parkinsonneurodegeneraçãoagregação de proteínasglicaçãoTeses de mestrado - 2023Departamento de Química e BioquímicaTese de mestrado, Bioquímica e Biomedicina , 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasParkinson’s disease (PD) is the second-most common neurodegenerative disorder, affecting 2–3% of the population aged over 65. Its pathological hallmarks are dopaminergic neuron loss and accumulation of Lewy bodies, intracellular proteinaceous aggregates containing alpha-synuclein (aSyn). Familial PD, caused by genetic mutations, constitutes only 5-10% of all cases, but the study of genes associated with familial forms provides important insight into disease mechanisms, also relevant for the idiopathic forms. aSyn can exhibit a range of conformations. Encompassing various species from monomers to fibrils, aSyn is also subject to posttranslational modifications and point mutations causative of familial PD. The E46K aSyn variant, found in familial PD cases, consistently demonstrates an increased aggregation propensity. Recently, our group was involved in the discovery of two novel aSyn mutations in PD patients, K58N and G14R, whose effect on aggregation is still poorly understood. In this context, this project focused on a comparative study of different forms of aSyn: recombinant human WT and mouse WT aSyn, as well as human aSyn carrying the K58N, G14R or E46K mutations. Using ThT fluorescence assays, gel electrophoresis, and microscopy, it was concluded that the mutant variants have a higher propensity for aggregation. In parallel, it was also investigated the impact of glycation, a non-enzymatic reaction between a sugar and a protein, on aSyn aggregation. Methylglyoxal and ribose were found to glycate aSyn, causing significant biochemical alterations. Mutant aSyn fibril formation was increased by glycation, yet it was reduced for WT aSyn, aligning with previous results from our group. Interestingly, aggregates formed with or without glycation seed endogenous aSyn aggregation, leading to the formation of similar types of inclusions upon microscopic evaluation. Future studies will benefit from using a combination of biochemical techniques, considering the inherent variability in the behaviour of aSyn, and a larger sample size to improve statistical significance.A Doença de Parkinson (DP), a segunda doença neurodegenerativa mais comum após a Doença de Alzheimer, afeta cerca de 2 a 3% da população acima dos 65 anos de idade. Esta doença é caracterizada pela perda de neurónios dopaminérgicos na substância negra e pela formação de corpos de Lewy, agregados proteicos intracelulares cujo componente principal é alfa-sinucleína (aSyn). Os sintomas incluem tremores em repouso, bradicinesia, rigidez muscular e instabilidade postural, entre outros, assim como sintomas não motores, tais como depressão, hiposmia, distúrbios do sono, obstipação e défice cognitivo. Apesar de que a DP hereditária, causada por mutações genéticas, constitua apenas 5 a 10% dos casos totais, sendo que a maioria dos casos ocorre de forma esporádica, o estudo de genes associados às formas hereditárias da doença fornece perspetivas cruciais sobre os mecanismos neuropatológicos subjacentes da patologia, que também podem ser relevantes para as formas idiopáticas da mesma. Isto, pois algumas das proteínas codificadas por genes associados à DP hereditária estão envolvidas numa série de vias moleculares que, quando perturbadas, podem desencadear uma neuropatologia semelhante à DP esporádica. Além disso, estudos de associação ao genoma (GWAS) confirmaram que alguns destes genes também são afetados na DP esporádica. Isto, juntamente com o facto de que a agregação e o transporte celular de aSyn têm-se tornado alvos terapêuticos nos últimos anos, torna crucial aprofundar a nossa compreensão dos comportamentos da aSyn relacionada com a doença para o desenvolvimento de terapias inovadoras e eficazes para tratar a DP. A aSyn é uma proteína intrinsecamente desordenada com cerca de 14 kDa. A ausência de uma estrutura terciária definida pode apresentar várias vantagens, nomeadamente a exposição de regiões capazes de interagir com vários potenciais ligandos e suscetíveis a modificações pós-traducionais (PTMs). Embora a função exata desta proteína permaneça desconhecida, sabe-se que desempenha um papel importante na regulação do tráfico de vesículas, síntese de dopamina e libertação de neurotransmissores. A aSyn é altamente dinâmica em termos das suas características estruturais. Existe em equilíbrio entre um estado unfolded e um estado ligado a membranas, adotando uma estrutura helicoidal. Além disso, sob condições patológicas, e devido à sua região NAC com propriedades amiloidogénicas, a aSyn monomérica é capaz de reunir-se em espécies oligoméricas de diferentes formas e tamanhos, que podem posteriormente evoluir para fibras agregados de ordem superior estáveis, ricos em estruturas de folhas-β, aptos a interagir com Tioflavina T (ThT). Os produtos finais do processo de montagem são altamente heterogéneos em termos de tamanho, forma e propriedades bioquímicas, o que juntamente com a possibilidade de sofrer PTMs ou a presença de mutações, torna o estudo desta proteína bastante desafiador. Uma das PTMs que altera as propriedades da aSyn é a glicação, uma reação não enzimática entre uma molécula de açúcar e os resíduos de lisina ou arginina de uma proteína. A glicação leva à formação irreversível de produtos finais de glicação avançada associados à aSyn (AGE-aSyn), capazes de formar ligações cruzadas entre proteínas, levando à agregação das mesmas. Também colaboram para a formação de espécies reativas de oxigénio e nitrogénio (ROS e RNS, respetivamente), contribuindo para a instabilidade global do sistema. Até à data, já foram identificadas várias mutações pontuais na aSyn associadas à DP hereditária. A mutação E46K, por exemplo, já foi extensamente estudada e demonstra, consistentemente, provocar um aumento na tendência para a agregação da aSyn. Recentemente, o nosso grupo esteve envolvido na descoberta de duas novas mutações, K58N e G14R, identificadas em pacientes com DP hereditária. No entanto, o efeito destas mutações na agregação da aSyn ainda é limitado. Este projeto foca-se num estudo comparativo entre diferentes formas de aSyn. Foram produzidas as variantes recombinantes wild-type (WT) de humano e de rato e as mutações K58N, G14R e E46K da aSyn humana. Utilizando ensaios de fluorescência de ThT, técnicas eletroforéticas e microscopia, foi possível concluir que as mutações estudadas têm uma maior propensão para a agregação. Além disso, foi possível ver que todas as variantes apresentam um perfil de agregação sigmoidal, característico da formação de amiloides, mas com diferentes velocidades para atingir o estado estacionário em que existe um equilíbrio da reação. Para mais, não foi detetada nenhuma correlação entre a velocidade de formação das fibras positivas a ThT e a quantidade das mesmas formada. Em paralelo, também se investigou o impacto da glicação no comportamento da aSyn. Os agentes de glicação estudados foram o metilglioxal (MGO) e ribose. Após um período de incubação de 60 horas, ambos os agentes de glicação foram capazes de produzir aSyn glicada, detetados pela medição da fluorescência das amostras a 390 nm, provocando alterações significativas nas propriedades bioquímicas da proteína. Foi possível observar que o tratamento com ribose levou à formação de estruturas globulares resistentes a SDS, enquanto o tratamento com MGO formava estruturas globulares que apenas eram detetáveis em condições não desnaturantes. Também foi visto que a incubação num período de 60 horas, com ou sem agente de glicação, levava à formação de espécies de elevado peso molecular (HMWS). Adicionalmente, embora ambos os açúcares aumentassem a produção de fibras detetáveis com ThT nos mutantes, a glicação a partir da ribose mostrou ser mais eficaz. No entanto, e em conformidade com resultados anteriores do nosso grupo, a glicação levou a uma menor produção de fibras para as variantes WT em comparação com a proteína incubada sem agente de glicação. Estes resultados foram confirmados com imagens de microscopia eletrónica das amostras. Para todas as condições apenas foram detetados oligómeros com exceção das variantes WT não glicadas, com as quais foi possível ver fibras de tamanhos variados. As fibras de aSyn WT de rato eram constituídas, na sua maioria, por duas fibras entrelaçadas entre si, enquanto as fibras de aSyn WT humanas eram constituídas por várias fibras paralelas entre si. Por fim, neste projeto também se estudou a capacidade de seeding da aSyn endógena de células HEK que expressavam aSyn-EGFP com a administração de AGEs-aSyn ou agregados de aSyn não glicada. As espécies oligoméricas da aSyn têm a capacidade de propagar-se de célula em célula, servindo como “blocos de construção” para a formação de novos agregados, o que contribui para a disseminação da patologia pelas diferentes regiões do cérebro. Para o estudo da capacidade de propagação da doença pelo sistema, as células foram incubadas durante 48 horas na presença de aSyn glicada com MGO ou ribose, ou proteína não glicada, sendo posteriormente submetidas a imunocitoquímica. As imagens obtidas por microscopia de fluorescência permitiram a deteção de inclusões de aSyn endógena na maioria das condições estudadas. Este projeto também destaca a variabilidade significativa no comportamento da aSyn nas experiências realizadas. Com este projeto reforça-se a ideia de que é crucial produzir proteína recombinante sob condições padronizadas de maneira a minimizar a variabilidade inter- e intralaboratorial. Contudo, é importante ter em mente que, ainda assim, proteína de um mesmo lote pode apresentar comportamentos distintos ao repetir as experiências sob as mesmas condições. A natureza intrínseca da variabilidade nos resultados da aSyn, juntamente com a necessidade de considerar diversos fatores como mutações, modificações e condições experimentais, acrescenta complexidade à investigação neste campo. Estudos futuros beneficiar-se-ão grandemente de uma abordagem integrada que combine várias técnicas bioquímicas. Isto permitirá um processo de validação mais robusto, assegurando que os resultados sejam consistentes em diferentes perspetivas analíticas. Além disso, um aumento substancial no tamanho da amostra e a otimização dos protocolos poderão desempenhar um papel fundamental na atenuação da variabilidade inerente observada nas experiências com aSyn. Um conjunto de dados mais extenso possibilitará uma análise mais abrangente e fortalecerá a significância estatística dos resultados, melhorando assim a fiabilidade e generalizabilidade das conclusões obtidas. À medida que navegamos pelas complexidades do comportamento da aSyn, estes passos representam medidas cruciais para estabelecer uma compreensão mais precisa e abrangente do seu papel em contextos neurodegenerativos.Outeiro, Tiago Fleming, 1976-Gomes, Cláudio MRepositório da Universidade de LisboaQuadros Ramón, Maria Ángel de2024-04-03T13:48:14Z202320232023-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/63922TID:203525710enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2025-03-17T15:13:41Zoai:repositorio.ulisboa.pt:10451/63922Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T03:37:27.448422Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse |
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