Role of Piezo1 mechanosensitive channel in elevated pressure-induced microglia reactivity
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| Publication Date: | 2023 |
| Format: | Master thesis |
| Language: | eng |
| Source: | Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) |
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Summary: | Dissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de Medicina |
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Role of Piezo1 mechanosensitive channel in elevated pressure-induced microglia reactivityPapel do canal mechanosensível Piezo1 na reatividade da microgllia induzida por pressão elevadaMicrogliaGlaucomaPiezo1Elevated hydrostatic pressureNeuroinflammationMicrogliaGlaucomaPiezo1Pressão hidrostática elevadaNeuroinflamaçãoDissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de MedicinaGlaucoma, a leading cause of irreversible vision loss, is characterized by retinal ganglion cell loss and optic nerve damage, where the main risk factors are elevated intraocular pressure and ageing. It has been shown that microglia-induced neuroinflammation plays a crucial role in the disease's onset and progression. The control of microglia-mediated neuroinflammation is sufficient to protect retinal ganglion cells from damage, reinforcing the crucial role of microglia in disease. In our group, it has been demonstrated that exposing microglia to elevated pressure induces the release of cytotoxic factors that promote retinal death. However, the sensor of elevated pressure in microglia has not been identified yet. Piezo1, a mechanosensitive ion channel, detects alterations in pressure and shear stress and its activation has been linked to inflammation. Piezo1 is expressed in microglia but its role in the retina and its contribution to neuroinflammation in glaucoma has not been explored. This study aimed to investigate the role of Piezo1 activation in elevated pressure-induced microglia reactivity.BV-2 cells were exposed to elevated hydrostatic pressure (70 mmHg above normal pressure) in normoxic conditions (EHP; 20% O2) and in hypoxic conditions (hEHP; 2% O2) for 4 and 24 hours, in the presence or absence of 0.5, 1 and 10 µM GsMTx4 (Piezo1 inhibitor). Cells were incubated with 1, 5 and 10 µM Yoda1 (Piezo1 agonist). Piezo1 protein levels were quantified by Western blot. Phagocytosis was assessed with fluorescent microbeads. NO production was assessed by Griess reaction assay and with the NO-sensitive probe DAF-FM. Protein levels of iNOS, TAZ, YAP and p-YAP (S397) were quantified by Western blot.This work showed that Piezo1 is expressed in BV-2 cells and the exposure to hEHP, leads to a slight increase in the channel expression. Intriguingly, Piezo1 activation showed a slight increase in phagocytosis efficiency, while exposure to hEHP showed no alterations in phagocytosis efficiency.The effect of Piezo1 activation in nitrosative stress showed no alterations in the medium nitrite concentration. However, when directly examining the production of NO, revealed that the exposure to hEHP significantly increased NO production. Piezo1 activation did not affect the total protein levels of TAZ, YAP, and p-YAP (S397). Regarding their subcellular location, Piezo1 activation did not affect TAZ nor YAP nuclear and cytosolic protein levels, however, it exhibited a tendency to decrease cytoplasmic levels of p-YAP (S397). Altogether this work showed that Piezo1 is expressed in BV-2 cells and might play a role in the reactivity of these microglia cell line once it showed a tendency to enhance phagocytosis efficiency and increase NO production with Yoda1 incubation as well as under EHP and hEHP, respectively. Piezo1 activation effect showed no significant effects in the YAP, TAZ and p-YAP (S397) subcellular location, however, it is required further investigation to better understand Piezo1 activation – induced microglia reactivity mechanisms.O glaucoma, uma das principais causas de perda irreversível da visão, é caracterizado pela perda de células ganglionares da retina e danos no nervo ótico, onde os principais fatores de risco são a pressão intraocular elevada e o envelhecimento. Foi demonstrado que a neuroinflamação induzida pela microglia desempenha um papel crucial no início e progressão da doença. Tem sido mostrado que o controlo da neuroinflamação mediada pelas células damicroglia é suficiente para proteger as células ganglionares da retina de danos, reforçando o papel crucial da microglia na doença. No nosso grupo, foi mostrado que a exposição da microglia à pressão elevada induz a liberação de fatores citotóxicos que promovem a morte das células da retina, nomeadamente das células ganglionares da retina. No entanto, o sensor na microglia que deteta as alterações da pressão na membrana plasmática ainda não foi identificado. Piezo1, um canal iónico mecanosensível, deteta alterações na pressão e tensão de cisalhamento cuja ativação tem sido associada à inflamação. Piezo1 é expresso na microglia, mas o seu papel na retina e a sua contribuição para a neuroinflamação no glaucoma ainda não foram explorados. Este estudo teve como objetivo estudar o papel da ativação do Piezo1 na reatividade da microglia induzida por pressão elevada.Células BV-2 foram expostas a pressão hidrostática elevada (70 mmHg acima da pressão normal) em condições de normoxia (EHP; 20% O2) e em condições de hipoxia (hEHP; 2% O2) por 4 e 24 horas, na presença ou ausência de 0,5, 1 e 10 μM GsMTx4 (inibidor doPiezo1). As células foram incubadas com 1, 5 e 10 μM Yoda1 (agonista do Piezo1). Os níveis de proteicos do canal Piezo1 foram quantificados por Western blot. A fagocitose foi avaliada com microesferas fluorescentes. A produção de NO foi avaliada pelo ensaio da reação de Griess e com a sonda DAF-FM. Os níveis proteicos de iNOS, TAZ, YAP e p-YAP (S397) foram quantificados por Western blot.Este trabalho mostrou que Piezo1 é expresso em células BV-2 e que, com a exposição ao hEHP, houve um ligeiro aumento na expressão do canal. Curiosamente, a ativação do Piezo1 mostrou um ligeiro aumento na eficiência da fagocitose, enquanto a exposição ao hEHP não mostrou alterações na eficiência da fagocitose.O efeito da ativação de Piezo1 no stress nitrosativo não mostrou alterações na concentração média de nitrito. No entanto, a avaliação direta da produção de NO, revelou que a exposição a hEHP aumentou significativamente a produção de NO.A ativação de Piezo1 não afetou os níveis proteicos totais de TAZ, YAP e p-YAP (S397). Em relação à sua localização subcelular, a ativação do Piezo1 não afetou os níveis proteicos, quer a nível nuclear quer a nível do citoplasma, de TAZ nem YAP, no entanto, exibiu uma tendência a diminuir os níveis citoplasmáticos de p-YAP (S397). Este trabalho mostrou que Piezo1 é expresso em células BV-2 e pode desempenhar um papel na reatividade desta linha celular de microglia, uma vez que mostrou uma tendência a aumentar a eficiência da fagocitose e a produção de NO com incubação de Yoda1, bem como sob EHP e hEHP, respetivamente. O efeito de ativação de Piezo1 não mostrou efeitos significativos na localização subcelular de YAP, TAZ e p-YAP (S397), no entanto, é necessária uma investigação mais aprofundada para compreender melhor os mecanismos de indução de reatividade na microglia induzidos pela ativação do Piezo1.FCT2023-10-23info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesishttps://hdl.handle.net/10316/113528https://hdl.handle.net/10316/113528TID:203534972engSoares, Ângela Marta Monteiroinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2024-02-21T20:51:06Zoai:estudogeral.uc.pt:10316/113528Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T06:06:25.410327Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse |
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