THERAPEUTIC POTENTIAL OF PARTHENOLIDE ON B-CELL HAEMATOLOGIC MALIGNANCIES

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Baptista, Mara Amuji da Silveira
Data de Publicação: 2024
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/10316/117421
Resumo: Dissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de Medicina
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spelling THERAPEUTIC POTENTIAL OF PARTHENOLIDE ON B-CELL HAEMATOLOGIC MALIGNANCIESPOTENCIAL TERAPÊUTICO DO PARTENOLIDE EM NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS DAS CÉLULAS BB-lymphoid malignanciesNF-kBParthenolideApoptosisOxidative stressNeoplasias linfoides das células BNF-kBPartenolideApoptoseStresse oxidativoDissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de MedicinaLymphoid neoplasms comprehend a highly heterogeneous group of diseases, including acute lymphoblastic leukaemia (ALL), chronic lymphocytic leukaemia (CLL) and multiple myeloma (MM), among others. These malignancies exhibit dysregulated NF-kB pathway, crucial for cell survival and proliferation. The inhibition of NF-kB pathway in lymphoid malignancies has emerged as a promising therapeutic option for these diseases. Parthenolide (PRT) is a naturally occurring sesquiterpene lactone that is derived from feverfew plant. Its potential as an anticancer agent has been extensively researched, and it has shown promising results in not only haematological neoplasms, but also in a variety of solid cancers, such as breast, lung, colorectal, prostate and ovarian cancers. PRT has a series of direct targets (e.g. p65, IkB kinase, IGF-1, BRAF) that have already been reported to affect several signalling pathways related to tumorigenesis and progression, mainly inhibiting growth, and inducing apoptosis. In this context, the aim of this study was to assess the therapeutic efficacy of PRT in in vitro models of B-cell neoplasms.To this end, three cell lines were used: 697 (B-ALL), HG-3 (CLL) and U266 (MM). Cells were incubated with PRT in different concentrations, ranging between 0.1-25 µM. Metabolic activity was evaluated after 24, 48 and 72 hours of incubation, using resazurin assay. Subsequent studies were performed using two concentrations, one common to all three cell lines and corresponding to 1 µM and a concentration closer to the IC50 (half maximal inhibition concentration). After a 72-hour incubation, cell death was evaluated by flow cytometry (FCM) using Annexin V/7AAD double staining and by optical microscopy using May Grünwald-Giemsa. Intracellular peroxides, superoxide anion levels, reduced glutathione (GSH) and mitochondrial membrane potential (∆Ψm) were measured by FCM using DCFH2-DA, DHE, MO and JC-1 fluorescent probes, respectively. Cell cycle distribution was also evaluated by FCM using PI/RNase kit. Finally, gene expression analysis was conducted by qPCR to assess expression levels of MYC, BAX, BCL-2, CASP9 and TXNRD1.The results demonstrate that PRT induced a decrease in metabolic activity in a dose-, time- and cell-line-dependent manner. 697 cell line is the most sensitive to PRT with an IC50 of 4.8 µM, at 72h, followed by HG3 cell line with an IC50 of 6.0 µM and U266, the least sensitive, with an IC50 of 22.4 µM. PRT induced cell death, mainly by apoptosis, and these results were confirmed by optical microscopy where cells displayed distinctive morphological features of apoptosis, namely blebbing, which leads to the formation of apoptotic bodies. Furthermore, PRT also induced a decrease in a dose-dependent manner of ∆Ψm in all cell lines, further confirming mitochondrial dysfunctions, which in turn are also highly associated with the intrinsic pathway of apoptosis. To better clarify the mechanisms of PRT in these neoplasms, oxidative stress was assessed in all cell lines. GSH levels and ROS (superoxide anion and/or peroxides) decreased in U266 cell line and increased in the HG3 cell line. In 697, peroxides dropped significantly, superoxide anion marginally increased, and GSH levels were similar to the control. To further assess if PRT possesses an antiproliferative effect, cell cycle was evaluated, and results show that PRT’s IC50 in U266 cell line induced cell cycle arrest in G2/M phase but didn’t seem to affect 697 and HG3. These findings suggest a potential cytotoxic and cytostatic effect of PRT in lymphoid malignancies in vitro.In conclusion, PRT exhibits anticancer activity in our models, paving the way for more studies to be conducted and as such, potentially increasing the treatment landscape for B-cell haematological malignancies.As neoplasias linfoides compreendem um grupo bastante heterogéneo de doenças, que inclui a leucemia linfoblástica aguda (LLA), a leucemia linfocítica crónica (LLC) e o mieloma múltiplo (MM), entre outras. Estas neoplasias são caraterizadas por exibirem disfunção da via do NF-kB. O NF-kB é um fator de transcrição crucial para a sobrevivência e proliferação celular. A inibição desta via em tumores linfoides surgiu como uma opção terapêutica promissora para estas doenças. O partenolide (PRT) é um inibidor da via do NF-kB de ocorrência natural derivada da planta matricária. O seu potencial como agente anticancerígeno tem sido amplamente estudado, e mostrou resultados promissores não só em neoplasias hematológicas, mas também numa variedade de tumores sólidos, como o cancro da mama, pulmão, colorretal, próstata e ovário. O PRT tem uma série de alvos diretos (por exemplo p65, cinase IkB, IGF-1, BRAF) que afetam várias vias de sinalização relacionadas com o cancro e com a sua progressão, dado ao facto de inibir o crescimento celular e induzir apoptose. O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia terapêutica do PRT em modelos in vitro de neoplasias linfoides.Neste estudo foram utilizadas três linhas celulares: 697 (LLA-B), HG3 (LLC) e U266 (MM). As células foram incubadas com PRT em diferentes concentrações, variando entre 0,1-25 µM. A atividade metabólica foi avaliada após 24, 48 e 72 horas de incubação, pelo ensaio da resazurina. Estudos subsequentes foram realizados utilizando duas doses, uma dose comum às três linhas celulares, correspondendo a 1 µM, e uma concentração próxima do IC50 (metade da concentração inibitória máxima). Após 72 horas de incubação, a morte celular foi avaliada por citometria de fluxo (FCM) utilizando dupla marcação com Annexina V/7AAD e por microscopia ótica utilizando a coloração de May-Grümwald Giemsa. Em seguida, foram avaliados, por FCM, os níveis intracelulares de peróxidos, anião superóxido, glutationa reduzida (GSH) e potencial de membrana mitocondrial (∆Ψm) utilizando as sondas fluorescentes DCFH2-DA, DHE, MO e JC-1, respetivamente. A distribuição do ciclo celular também foi avaliada por FCM utilizando o kit PI/RNase. Por fim, a análise da expressão génica foi realizada por qPCR de modo a avaliar os níveis de expressão de MYC, BAX, BCL-2, CASP9 e TXNRDI. Os resultados demonstram que o PRT induziu uma diminuição da atividade metabólica de forma dependente da dose, do tempo e da linha celular. A linha celular 697 é a mais sensível à PRT, com um IC50 de 4,8 µM, às 72h, seguida da linha HG3 com um IC50 de 6,0 µM, e da U266, a menos sensível, com um IC50 de 22,4 µM. O PRT induziu morte celular, principalmente por apoptose, e resultados confirmados por microscopia ótica, onde verificamos que as células exibiram características morfológicas típicas da apoptose, nomeadamente a formação de prolongamentos da membrana citoplasmática, blebs, que são responsáveis pela formação de corpos apoptóticos. De facto, também verificamos que o PRT induziu uma diminuição, dependente da concentração, do ∆Ψm em todas as linhas celulares, sugerindo que este induz disfunções mitocondriais, que por sua vez estão altamente associadas à via intrínseca da apoptose. Para melhor clarificar os mecanismos do PRT nestas neoplasias, avaliou-se o stresse oxidativo nas linhas celulares. Os níveis de GSH e ROS (anião superóxido e/ou peróxidos) diminuíram na linha celular U266 e aumentaram na linha HG3. Nas 697, os peróxidos diminuíram significativamente, o anião superóxido aumentou ligeiramente, e os níveis de GSH foram semelhantes aos do controlo. Adicionalmente, de modo a perceber se o PRT apresentava um efeito antiproliferativo, foi avaliado o ciclo celular, e os resultados mostraram que o IC50 do PRT na linha celular U266 induziu bloqueio do ciclo celular na fase G2/M, porém não teve o mesmo efeito nas linhas 697 e HG3. Estes achados sugerem um potencial efeito citotóxico e citostático do PRT nos nossos modelos in vitro. Concluindo, o PRT possui atividade anticancerígena nos modelos estudados, abrindo caminho para mais estudos com este fármaco e, assim, potencialmente aumentar o panorama do tratamento para as neoplasias hematológicas da linhagem B.Outro - This research was funded by ACIMAGO. The Centre for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB) and the Institute for Clinical and Biomedical Research (ICBR) are supported by the Foundation for Science and Technology (FCT), Portugal, through the Strategic Projects UIDB/04539/2020 (10.54499/UIDB/04539/2020) and UIDB/04539/2020 (10.54499/UIDB/04539/2020) and Associated Laboratory funding LA/P/0058/2020 (10.54499/LA/P/0058/2020).2024-10-222030-10-21T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesishttps://hdl.handle.net/10316/117421https://hdl.handle.net/10316/117421TID:203769929engBaptista, Mara Amuji da Silveirainfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2025-04-02T17:34:09Zoai:estudogeral.uc.pt:10316/117421Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T06:11:22.107559Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse
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