Targeting human aquaporin function : physiological and chemical approaches
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| Publication Date: | 2018 |
| Language: | eng |
| Source: | Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) |
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Summary: | Tese de doutoramento, Farmácia (Bioquímica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2018 |
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Targeting human aquaporin function : physiological and chemical approachesTeses de doutoramento - 2018Domínio/Área Científica::Ciências Médicas::Medicina BásicaTese de doutoramento, Farmácia (Bioquímica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2018Aquaporins (AQPs) are a group of small membrane proteins belonging to a highly conserved family of membrane proteins called MIPs (Major Intrinsic Proteins) that are responsible for the bidirectional transport of wate (orthodox aquaporins) and also small uncharged solutes (aquaglyceroporins) across cell membranes, in response to osmotic or solute gradients. Rapid water flux across membranes is crucial to maintain the water homeostasis in many epithelia and endothelia involved in fluid transport. In addition, due to the unique ability of aquaglyceroporins to transport glycerol in addition to water, they have important roles in glycerol metabolism and skin hydration in non-fluid transporting tissues such as skin, fat and liver. The thesis introduction (Chapter 1) presents an overview of aquaporins structure, their main biological functions and related pathologies, with special emphasis on the so far described mechanisms of regulation. In the first part of this thesis (Chapter 2), we report the discovery of a new role for Aquaporin-5 (AQP5, an orthodox aquaporin) in adipocyte biology, where Aquaporin-7 (AQP7, an aquaglyceroporin) has been the mainly characterized protein in adipose tissue responsible for glycerol efflux. A better understanding of aquaporin regulation and gating would allow manipulation of their activity facilitating the identification of new putative modulators. A cellular model optimized to assess the function of aquaporins and discriminate individually each isoform, instead of mammalian cells where more than one isoform is usually expressed, is a useful tool to study aquaporin regulation. The second part of this thesis (Chapter 3) is dedicated to the functional characterization of different mammalian aquaporin isoforms (AQP3, AQP5, AQP7 and AQP10), using a yeast heterologous expression system devoided of endogenous aquaporins, a background where analysis is unlikely to be compromised by the co-expression of other aquaporin isoforms. Using the stopped-flow technique to evaluate the channel permeability for water and for glycerol, we were able to disclose gating mechanisms of aquaporin isoforms, being given special emphasis to the regulation by pH and phosphorylation. In the third part of this thesis (Chapter 4), a screening of several small gold compounds as inhibitors for Aquaporin-3 (AQP3, an aquaglyceroporin) was performed aiming at identifying new modulators with potential therapeutic use.A água possui um papel crucial para a vida devido às suas propriedades únicas. Todos os processos bioquímicos e fisiológicos de um organismo dependem da presença de água, sendo esta o componente fundamental na manutenção da homeostase celular. Nas células eucarióticas, a água encontra-se distribuída pelos vários compartimentos intracelulares separados entre si por membranas intracelulares e do meio extracelular pela membrana plasmática. Estas membranas de composição bilipídica são normalmente impermeáveis à maioria dos solutos polares e/ou carregados, cuja passagem é facilitada através de canais membranares específicos. No entanto estas membranas são bastante permeáveis à água, sendo então propostas três vias de transporte: por difusão simples, por transporte passivo associado ao transporte de iões e solutos e por canais específicos para a água. Atualmente sabe-se que a maioria das células de um organismo possui proteínas específicas – as aquaporinas – que conferem à membrana uma permeabilidade à água de cerca de 5 a 10 vezes superior às membranas que não possuem estas proteínas. Devido às suas características estruturais, as aquaporinas permitem um rápido transporte bidirecional de água, seletivo e regulado, em resposta a gradientes osmóticos, ao mesmo tempo que previnem a passagem de protões e iões através da membrana plasmática. Em mamíferos, são conhecidas até à data treze isoformas (AQP0-AQP12) que são classificadas em três grupos de acordo com a sua sequência primária, localização celular e seletividade em 1) aquaporinas ortodoxas, primariamente seletivas à água; 2) aquagliceroporinas, para além de água também transportam pequenos solutos neutros, como glicerol e ureia; e 3) super-aquaporinas, que são encontradas em membranas intracelulares e possuem menor homologia. No entanto, a lista de substâncias que são capazes de permear as diferentes aquaporinas tem aumentado ao longo do tempo. Recentemente, para além de água e glicerol, foi também descrito o transporte facilitado através de algumas isoformas de arsenito, amoníaco e peróxido de hidrogénio. Devido à grande diversidade de tecidos onde são encontradas as aquaporinas, o seu papel de facilitar o transporte de água e/ou solutos através das membranas plasmáticas é importante em vários processos fisiológicos, tais como: secreção de fluido glandular, mecanismo de concentração urinária, excitabilidade neuronal, metabolismo dos lípidos, hidratação epidérmica e balanço de água no cérebro. A observação do fenótipo de ratinhos geneticamente modificados com knock-out de determinadas aquaporinas revelou funções fisiológicas muito importantes no aparecimento e desenvolvimento de várias patologias, como epilepsia, edema cerebral, glaucoma, cancro e obesidade. No Capítulo 1 é apresentada uma introdução geral que visa proporcionar um conhecimento abrangente sobre as principais funções das aquaporinas humanas e patologias associadas, dando especial atenção aos diferentes mecanismos de regulação já conhecidos. Na primeira parte dos resultados desta tese (Capítulo 2), através da construção de linhas celulares de pré adipócitos de ratinho 3T3-L1 com diferentes níveis de expressão da Aquaporin-5 (cenário de ganho e perda de função) foi possível estabelecer um novo e determinante papel desta aquaporina na diferenciação dos adipócitos. Na segunda parte dos resultados desta tese (Capítulo 3), pretendeu-se usar um sistema de expressão heteróloga em Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) para permitir avaliar de forma individual a função de cada aquaporina. A levedura S. cerevisiae é considerada um valioso sistema de expressão heteróloga para estudar inúmeras proteínas devido à elevada homologia funcional entre esta e os eucariontes superiores, incluindo mamíferos. Pelo facto de existir uma grande biblioteca de estirpes disponíveis, ser de fácil manipulação genética, ser pouco dispendioso em comparação com as culturas de células animais e poderem ser testadas uma variedade de condições externas, este sistema oferece condições experimentais ótimas para estudar a especificidade e regulação das aquaporinas. Após a expressão e confirmação da sua localização celular, procedeu-se à caracterização da função de cada isoforma, utilizando a técnica de interrupção brusca de fluxo, seguindo a variação de volume celular por fluorescência quando se introduz uma perturbação no meio extracelular. Os fluxos de água através da membrana celular causados por gradientes de pressão osmótica (de solutos impermeantes ou permeantes) provocam alterações transitórias de volume, até se atingir um novo volume final de equilíbrio osmótico. A velocidade com que as alterações de volume ocorrem e o tempo que a célula leva a re-estabelecer o seu novo equilíbrio osmótico dependem diretamente das características intrínsecas de transporte da membrana, em particular da quantidade de canais específicos para a água e para o soluto em questão. No Capítulo 3 foram estudadas quatro isoformas diferentes (AQP3, AQP5, AQP7 e AQP10) e os seus mecanismos de regulação por pH e fosforilação foram revelados pela primeira vez. Vários esforços têm vindo a ser feitos com o intuito de desenvolver possíveis fármacos para tratamento das aquaporinopatias, mas até agora nenhum composto se revelou qualificado para estudos in vivo, quer pela sua fraca solubilidade quer pela sua baixa capacidade de inibição. Na terceira parte dos resultados desta tese (Capítulo 4), deu-se especial atenção à descoberta de novos compostos organometálicos, inibidores da função da Aquaporina-3, que poderão ser usados para benefício clínico na prevenção ou tratamento das várias patologias associadas.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), SFRH/BD/52384/2013, Programa de Doutoramento Medical Biochemistry and Biophysics Doctoral Programme (M2B-PhD)Rodrigue, Maria da Graça Soveral, 1959-Casini, Casini, AngelaRepositório da Universidade de LisboaMósca, Andreia F2021-05-30T00:30:15Z201820182018-01-01T00:00:00Zdoctoral thesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/34424TID:101487827enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2025-03-17T13:56:40Zoai:repositorio.ulisboa.pt:10451/34424Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T02:58:47.631935Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse |
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