Descoberta de novas suberinases através de uma abordagem metagenómica

• Autor(a) principal: Bordadágua, João Nuno Lágio
• Data de Publicação: 2013
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10773/13374
• topic: Biotecnologia molecular; Cortiça; Lacase

A espécie de formigas, Crematogaster scutellaris, nidifica na cortiça de sobreiros (Quercus suber L.), escavando galerias extensas que diminuem o valor comercial deste produto. Acredita-se que a degradação da cortiça é efetuada por enzimas digestivas secretadas pelas glândulas da própria formiga, como também por microrganismos simbiontes presentes no seu sistema digestivo intestinal – o microbioma intestinal. Tendo em conta que a cortiça é composta maioritariamente por suberina, o objetivo principal deste trabalho foi a pesquisa de genes do microbioma intestinal que codificam suberinases (cutinases, feruloil esterases e lacases). Para tal, estabeleceu-se uma estratégia de amplificação dos genes das enzimas alvo e respetiva sequenciação e anotação funcional. Na primeira fase efetuou-se o estudo da composição taxonómica do microbioma intestinal. O DNA total da comunidade microbiana presente no intestino e estômago das formigas (metagenoma) foi extraído e as sequências correspondentes aos genes do rRNA 16S amplificadas por PCR e pirosequenciadas. Da comunidade bacteriana destaca-se a predominância do filo Proteobacteria com 68,0% do número total de sequências, seguindo-se os filos Bacteroidetes (17,2%), Firmicutes (7,0%), Acidobacteria (4,6%) e Actinobacteria (3,2%). Os taxa identificados foram pesquisados na literatura para a presença de genes de cutinases, feruloil esterases e lacases. Numa segunda fase, recorrendo a bases de dados e ferramentas bioinformáticas, procedeu-se ao desenho de primers “consenso” para zonas conservadas de cutinases, feruloil esterases e lacases e as enzimas alvo foram amplificadas a partir do DNA do microbioma intestinal. As enzimas foram posteriormente pirosequenciadas para identificação e anotação funcional. A estratégia funcionou bem para as lacases, no entanto não foi possível identificar sequências para as restantes enzimas alvo (cutinases e feruloil esterases). A anotação funcional das sequências obtidas identificou 4 lacases bacterianas pertencentes à família multi-cobre oxidase, sendo 3 anotadas como proteína A de resistência ao cobre e uma como precursor da oxidase CueO. Os genes apresentaram elevada homologia com lacases dos géneros Rhodococcus, Serratia e Tetrasphaera, sugerindo que se trate de novas enzimas com capacidade de oxidação de compostos fenólicos presentes na lenhina da cortiça. Apesar dos resultados animadores, são necessários estudos subsequentes para desvendar a totalidade dos genes codificantes de lacases, e comprovar a sua especificidade e actividade enzimáticas em vários substratos fenólicos.