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Identification of Arl13b GTPase-activating proteins towards the impairment of tumor progression

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Main Author: Ferreira, Inês Margarida Castro
Publication Date: 2018
Format: Master thesis
Language: eng
Source: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
Download full: http://hdl.handle.net/10451/37265
Summary: Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2018
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spelling Identification of Arl13b GTPase-activating proteins towards the impairment of tumor progressionArl13bArf GAPsMigração celularInvasão celularProgressão tumoralTeses de mestrado - 2018Departamento de Biologia VegetalTese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2018Cancer metastasis relies on cancer cell migration and invasion of tissues surrounding the primary tumor and is the leading cause of cancer-related deaths. Our group previously showed that the small GTPase Arl13b positively regulates breast cancer cell migration, invasion and metastasis. In fact, this protein is widely expressed in most normal human tissues and its expression is enhanced in several tumorigenic tissues. Therefore, Arl13b inactivation represents a promising therapeutic strategy to control cancer progression. However, any GTPase-activating proteins (GAPs), which inactivate small GTPases, are known for Arl13b. Thus, my aim was to identify GAPs that promote the inactive conformation of Arl13b, contributing to unravel regulators of the activity of this protein. I found that Arl13b co-immunoprecipitates with the Arf GAPs ASAP1, ASAP3 and ACAP1, but not with GIT1, using total protein extracts obtained from MDA-MB-231 breast cancer cells. Moreover, the coimmunoprecipitation was enhanced in the presence of GTPS, compared to excess GDP, indicating that the interactions occur in a GTP-dependent manner. Additionally, I observed that ASAP1, ASAP3 and ACAP1 co-localize with Arl13b in MDA-MB-231 cells in structures associated with the plasma membrane and in actin-rich structures involved in cell migration or invasion. To assess if these Arf GAPs can induce the GTP hydrolysis activity of Arl13b, an in vitro GTPase activity assay was performed using recombinant purified proteins. I observed that ASAP1 and ASAP3 do not promote Arl13b GTP hydrolysis, while the result obtained for ACAP1 was not conclusive. Previous studies indicate that ASAP3 silencing leads to decreased cancer cell migration and invasion, similar to the Arl13b silencing, but the effect of ASAP1 silencing on these processes has been contradictory. On the other hand, ACAP1 has not been directly implicated in cancer. I found that ASAP1 and ASAP3 are upregulated in highly invasive breast cancer cell lines, similar to ARL13B. Furthermore, the results obtained show that ACAP1 silencing leads to the enhancement of breast cancer cell migration and invasion. These findings correlate with the downregulation of ACAP1 in more invasive breast cancer cell lines, contrary to what occurs with ARL13B. Altogether, these results provide new insights into the regulation and molecular mechanisms of Arl13b in cancer progression, suggesting that ASAP1 and ASAP3 act as Arl13b effectors, while ACAP1 emerge as a promising candidate with GAP activity on Arl13b.O processo de metastização depende da migração e invasão de células cancerígenas para os tecidos circundantes ao tumor primário e é a principal causa das mortes relacionadas com cancro. O nosso grupo descobriu que a pequena GTPase Arl13b regula positivamente a migração, invasão e metastização de células de cancro de mama. De facto, esta proteína é amplamente expressa na maioria dos tecidos normais humanos, tendo a sua expressão aumentada em diversos tecidos tumorais. Desta forma, a inativação da Arl13b representa uma estratégia terapêutica promissora para controlar a progressão tumoral. Contudo, não são conhecidas proteínas indutoras da atividade GTPásica (GAPs), que inactivam proteínas deste tipo, para a Arl13b. Assim, o meu objetivo foi identificar GAPs que promovessem a conformação inativa da Arl13b, contribuindo para a descoberta de fatores que regulam a atividade desta proteína. Os resultados obtidos indicam que a Arl13b co-imunoprecipita com as Arf GAPs ASAP1, ASAP3 e ACAP1, mas não com a GIT1, usando extratos de proteína total de células de cancro de mama MDA-MB-231. Além disso, os resultados mostram que a co-imunoprecipitação aumenta na presença de GTPS, comparando com excesso de GDP, indicando que as interações ocorrem de uma forma dependente de GTP. Adicionalmente, observei que a ASAP1, ASAP3 e ACAP1 co-localizam com a Arl13b nas células MDA-MB-231 em estruturas associadas à membrana plasmática e em estruturas ricas em actina envolvidas na migração ou invasão celulares. Para identificar quais destas Arf GAPs poderiam induzir a atividade de hidrólise de GTP da Arl13b, utilizou-se um ensaio in vitro de atividade GTPásica, recorrendo a proteínas recombinantes purificadas. Verifiquei que a ASAP1 e a ASAP3 não promovem a hidrólise de GTP pela Arl13b, enquanto que o resultado obtido para a ACAP1 não foi conclusivo. Estudos anteriores indicam que o silenciamento da ASAP3 resulta na diminuição da migração e invasão de células tumorais, tal como o silenciamento da Arl13b, enquanto que o efeito do silenciamento da ASAP1 nestes processos tem sido contraditório. Por outro lado, não há estudos que demonstrem um papel direto da ACAP1 no cancro. Descobri que os genes ASAP1 e ASAP3 são sobreexpressos em linhas celulares de cancro de mama altamente invasivas, de forma análoga ao gene ARL13B. Além disso, os resultados obtidos demonstram que o silenciamento da ACAP1 leva a um aumento da migração e invasão de células de cancro de mama. Isto correlaciona-se com a reduzida expressão do gene ACAP1 em linhas celulares de cancro de mama mais invasivas, contrariamente ao que foi verificado para o gene ARL13B. Em conjunto, estes resultados contribuem para o conhecimento da regulação e dos mecanismos moleculares da Arl13b na progressão tumoral, sugerindo que a ASAP1 e a ASAP3 atuam como efetores da Arl13b, enquanto que a ACAP1 surge como um candidato promissor a GAP da Arl13b.Barral, DuarteZilhão, Rita, 1959-Repositório da Universidade de LisboaFerreira, Inês Margarida Castro2021-12-26T01:30:16Z201820182018-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/37265TID:202192245enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2025-03-17T14:04:25Zoai:repositorio.ulisboa.pt:10451/37265Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T03:02:07.319514Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse
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