Mycobacterium tuberculosis host adaptation and evolution reflected by defense mechanisms against oxidative stress

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Main Author: Mestre, Olga Maria Elviro, 1984-
Publication Date: 2012
Language: eng
Source: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
Download full: http://hdl.handle.net/10451/7624
Summary: Tese de doutoramento, Farmácia (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2012
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spelling Mycobacterium tuberculosis host adaptation and evolution reflected by defense mechanisms against oxidative stressTeses de doutoramento - 2012Tese de doutoramento, Farmácia (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2012Part of the success of Mycobacterium tuberculosis lies in its ability to thrive inside macrophages, where it is exposed to strong antimicrobials molecules, such as reactive oxygen species (ROS). However, the role of defense mechanisms against ROS in M. tuberculosis pathogenesis remains unclear. We used, for the first time, a functional genomic approach to investigate M. tuberculosis responses against ROS. By screening a transposon mutant library we identified a high number of mutants, with increased susceptibility to H2O2, in genes related to cell envelope functions, including mmpL9. This revealed the importance of M. tuberculosis cell envelope against oxidative stress. However, we have also identified genes implicated in other kind of defense mechanism against ROS, such as moaD1. Infection of human macrophages has shown that both mmpL9 and moaD1 have a role in M. tuberculosis intracellular lifestyle, and previous studies suggested the same for several other genes identified during our screening. Therefore, these represent potential virulence factors useful for the development of future anti-tuberculosis strategies. DNA repair, recombination and replication (3R) are important mechanisms in maintaining genome stability by repairing DNA damages, such as those induced by ROS, however, variations on 3R genes potentially increase genomic variability, due to an increase in mutation rates. Thus, analysis of polymorphisms in 3R genes could indicate which strains are more prone to adapt and evolve. We have analyzed polymorphisms in 3R genes in a collection of strains of a successful family of M. tuberculosis strains, the Beijing/W family. Specific 3R polymorphisms were found to characterize particular groups of Beijing/W strains for which a phylogeny was constructed. Certain groups were found to be predominant, suggesting that strains of these genotypes might have some selective advantage. Therefore, particular 3R SNPs may define pathogenic features that have contributed to the evolution of the Beijing/W family.Mycobacterium tuberculosis, a bactéria responsável pela tuberculose, infecta cerca de 1/3 da população mundial e é responsável pela morte de aproximadamente 1,5 milhões de pessoas por ano. Estes números podem ser explicados, em parte, pela capacidade desta bactéria persistir no interior de macrófagos, num ambiente extremamente agressivo, no qual é exposta a diferentes moléculas antimicrobianas tais como as espécies reactivas de oxigénio. Estas, sendo altamente reativas, causam danos em todo o tipo de moléculas incluindo lípidos, proteínas e DNA. Desta forma, os mecanismos de defesa utilizados pelo M. tuberculosis contra as espécies reativas de oxigénio são sem dúvida importantes para este, porém, o seu papel na virulência e patogénese desta bactéria ainda é pouco claro. O trabalho desenvolvido nesta tese consistiu na investigação dos mecanismos de defesa utilizados pelo M. tuberculosis contra as espécies reactivas de oxigénio. Com este objectivo, realizou-se pela primeira vez, um screening de uma biblioteca de mutantes construída por transposição, na estirpe clinica da família Beijing/W - GC1237, de forma a selecionar mutantes sensíveis a espécies reativas de oxigénio. A análise de cerca de 6000 mutantes permitiu a selecção de 18, sensíveis a peróxido de hidrogénio, para os quais a amplificação e posterior sequenciação do sítio de inserção do transposão levaram à identificação de 11 genes. Verificou-se que grande parte dos genes apresenta funções associadas ao invólucro celular bacteriano, o que revela que o invólucro do M. tuberculosis representa a primeira barreira de defesa contra as espécies reactivas de oxigénio nesta bactéria. O gene mmpL9 foi um dos identificados, cuja proteína se encontra possivelmente envolvida no transporte de lípidos para o invólucro celular. Curiosamente, três mutantes com diferentes mutações neste gene foram seleccionados. Identificaram-se também alguns genes envolvidos noutro tipo de mecanismos tais como, moaD1, envolvido na síntese do cofactor molibdénio. Uma vez que o M. tuberculosis tem de fazer face às espécies reativas de oxigénio no interior de macrófagos, o passo seguinte consistiu em analisar o fenótipo de alguns destes mutantes nestas células. Para o efeito, macrófagos humanos foram infectados com um dos mutantes no gene mmpL9 ou com o mutante no gene moaD1, uma vez que estudos anteriores demonstraram o papel de diferentes MmpLs na virulência desta bactéria e que outros genes envolvidos na síntese do cofactor molibdénio são importantes para a sobrevivência do M. tuberculosis no interior de macrófagos. Em ambos os casos observou-se uma diminuição na capacidade de crescimento destas estirpes no interior destas células, em comparação com a estirpe selvagem. A complementação destas estirpes mutantes restaurou o fenótipo da estirpe selvagem, o que demonstra o papel destes genes no crescimento de M. tuberculosis em macrófagos humanos. Porém, a complementação restaurou apenas parcialmente a sensibilidade destes mutantes às espécies reactivas de oxigénio in vitro, em comparação com a estirpe selvagem. No entanto, mmpL9 e moaD1 deverão ter um papel na resposta às espécies reativas de oxigénio em M. tuberculosis, caso contrário, a complementação não teria restaurado de todo o fenótipo selvagem, nas condições referidas. A comparação da sequência do gene mmpL9 da nossa estirpe selvagem, GC1237, com a estirpe de referência laboratorial, H37Rv, revelou a presença de uma deleção de um nucleótido na posição 218. Contudo, os nossos resultados obtidos a partir da infecção de macrófagos com o mutante mmpL9 e com a mesma estirpe após complementação da mutação sugerem que o gene mmpL9 deverá ser expresso apesar desta deleção. É possível que ocorra uma reniniação da tradução a partir de um codão de iniciação situado a montante da deleção, na posição 258, no gene mmpL9. Para além disso, a complementação do nosso mutante mmpL9 com o respectivo gene da estirpe H37Rv, restaurou apenas parcialmente o fenótipo da estirpe selvagem, GC1237, durante a infecção de macrófagos. Estas observações sugerem que a proteína MmpL9 na estirpe GC1237 poderá ser diferente da existente na estirpe H37Rv. A análise da sequência de todos os genes mmpL existentes no genoma de M. tuberculosis, numa coleção de estirpes que representam diferentes famílias, sugeriu que a deleção identificada poderá realmente ter um efeito na proteína. Verificou-se ainda que esta deleção é aparentemente específica para todas as estirpes modernas da família Beijing. Isto indica que a deleção do nucleótido 218 poderá ter conferido alguma vantagem selectiva a estas estirpes que contribuiu para a sua evolução. Para além de moaD1 e mmpL9, alguns dos outros genes identificados durante o screening como importantes para a resposta de M. tuberculosis às espécies reativas de oxigénio, foram igualmente descritos, em estudos anteriores, como importantes para a capacidade desta bactéria sobreviver intracelularmente. Isto indica uma correlação entre sensibilidade ao stress oxidativo e capacidade de sobreviver ou replicar-se no interior de macrófagos. No entanto, a infecção de macrófagos tratados com inibidores da NADPH oxidase, a enzima que produz as espécies reativas de oxigénio nestas células, com os mutantes nos genes mmpL9 e moaD1, não permitiu confirmar esta hipótese. É possível que estes mutantes sejam sensíveis a outras moléculas antimicrobianas encontradas no interior do macrófago, tais como as espécies reativas de azoto, que, em conjunto com as espécies reativas de oxigénio, são responsáveis pelo crescimento atenuado observado em macrófagos. Em conclusão, este trabalho permitiu a identificação de genes envolvidos na defesa do M. tuberculosis contra as espécies reactivas de oxigénio, os quais aparentam ter igualmente um papel na sobrevivência desta bactéria nas suas células hospedeiras, os macrófagos. Estes genes representam potenciais factores de virulência que poderão ser úteis para o desenvolvimento de futuros antibióticos ou vacinas. Numa segunda parte desta tese, realizou-se uma análise dos polimorfismos existentes em genes de reparação, recombinação e replicação (3R) de DNA numa família específica de estirpes de M. tuberculosis, a família Beijing. Os mecanismos de reparação, recombinação e replicação são extremamente importantes na manutenção da estabilidade genómica, através da reparação de danos causados no DNA, tais como os induzidos pelas espécies reativas de oxigénio. Por outro lado, estes mecanismos podem ser igualmente responsáveis pela introdução de variabilidade genética. Polimorfismos nos genes que codificam para as proteínas envolvidas nestes mecanismos poderão induzir um aumento na taxa de mutação, e consequentemente, a acumulação de mutações vantajosas para as estirpes, como por exemplo, mutações responsáveis pela resistência a antibióticos. Deste modo, a análise de polimorfismos nos genes 3R poderá indicar que estirpes estão mais predispostas a adaptar-se ou evoluir. A família Beijing é uma família de M. tuberculosis que apresenta uma maior virulência e que tem sido identificada um pouco por todo o mundo como estando frequentemente associada a resistência a antibióticos. Deste modo, analisaram-se polimorfismos em genes 3R numa coleção de estirpes Beijing, isoladas em várias partes do mundo. Diferentes polimorfismos foram identificados que permitiram a discriminação de vários grupos, para os quais foi construída uma árvore filogenética. Estes resultados foram congruentes com os resultados obtidos utilizando outros marcadores genéticos, o que significa que as mesmas associações filogenéticas foram obtidas, para a colecção de estirpes utilizada neste estudo, usando polimorfismos nos genes 3R ou outro tipo de marcadores genéticos. Uma grande percentagem das estirpes foi agrupada num dos grupos, Bmyc10, que incluiu estirpes isoladas em diferentes partes do mundo. Um estudo anterior demonstrou que estirpes com características genéticas que definem as deste grupo são igualmente predominantes numa outra região geográfica, não representada no nosso estudo. Em conjunto, estes resultados sugerem que o genótipo das estirpes do grupo Bmyc10 poderá ter-lhes conferido alguma vantagem selectiva que permitiu a sua evolução. Isto é igualmente sugerido num estudo anterior, no qual a caracterização do efeito da mutação no gene mutT2, que caracteriza todas as estirpes do grupo Bmyc10, indica que esta induz uma alteração na função da proteína que pode ser vantajosa para as estirpes que a possuem. Portanto, alguns dos polimorfismos identificados no nosso estudo poderão ter um efeito na função das respectivas proteínas, o que significa que este tipo de análise é importante para compreender o significado dos mesmos. Em conclusão, a análise de polimorfismos em genes 3R demonstrou que diferentes grupos podem ser identificados na família Beijing caracterizados por polimorfismos específicos. Estes podem ter conferido alguma vantagem que permitiu a expansão de certos grupos e contribuiu para a evolução desta família. A análise da variabilidade genética entre estirpes é importante uma vez que estas podem reflectir diferenças patogénicas. Este estudo poderá contribuir para aprofundar os nossos conhecimentos acerca dos mecanismos que determinam o êxito das estirpes da família Beijing.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/39079/2007); projeto TB-ADAPT (LSHP-CT-2006-037919) - European Commission baseado na Health Cooperation Work Programme of the 6th Framework Programme; outros projetos TB-VIR (Grant agreement n° 200973) e NEWTBVAC (HEALTH-F3-2009-241745) do 7th Framework Programme.Gicquel, BrigittePimentel, Madalena Maria Vilela, 1961-Repositório da Universidade de LisboaMestre, Olga Maria Elviro, 1984-2013-02-01T09:41:52Z20122012-01-01T00:00:00Zdoctoral thesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/7624enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2025-03-17T12:56:20Zoai:repositorio.ulisboa.pt:10451/7624Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T02:31:26.028673Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse
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