Deciphering glycan:protein interactions in the Human Gut Microbiome – A combined high-throughput and structural approach

• Main Author: Correia, Viviana Gomes
• Publication Date: 2023
• Language: eng
• Source: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
• Download full: http://hdl.handle.net/10362/163334
• topic: Human Microbiome; Bacteroides ovatus; Bacteroides thetaiotaomicron; Protein-glycan (carbohydrate) recognition; High-throughput protein production; Glycan Microarrays; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Outras Engenharias e Tecnologias

O tracto gastrointestinal humano é ocupado pelo microbioma, uma vasta comunidade microbiana capaz de utilizar, como nutrientes, diversos hidratos de carbono (geralmente designados de glicanas) provenientes da dieta ou da mucosa epitelial do hospedeiro. Alterações no influxo de glicanas restruturam a abundância e diversidade desta comunidade com concomitante impacto na saúde e nutrição humana. Estirpes predominantes, como as do filo Bacteroidetes, possuem diversos conjuntos de genes específicos para cada substrato, permitindo a estas bactérias lidar com a flutuação de hidratos de carbono. Cada conjunto codifica todos os elementos necessários ao reconhecimento e degradação de uma glicana específica, em particular diversas enzimas associadas a módulos não catalíticos de ligação a hidratos de carbono (CBMs) e proteínas de superfície para ligação a glicanas (SusD-like) que podem reflectir a especificidade dos sistemas. À medida que se acumulam dados genómicos e metagenómicos, há uma necessidade urgente de caracterizar estes sistemas de reconhecimento ao nível funcional e estrutural. O trabalho de investigação desenvolvido nesta Tese pretendeu o desenvolvimento e implementação de uma estratégia high-throughput para a identificação e caracterização de novas interacções proteína glicanas, combinando: i) a selecção bioinformática e a produção de proteínas recombinantes com ligação putativa a hidratos de carbono, ii) o rastreio da ligação dessas proteínas e atribuição de ligandos específicos usando a tecnologia de microarrays de glicanas que permitiu replicar, num formato miniaturizado, a diversidade estrutural de glicanas presente no intestino, incluindo glicanas derivadas de mamíferos, plantas ou agentes patogénicos, e iii) a caracterização e análise estrutural dos complexos proteína-glicana seleccionados, utilizando cristalografia de raios X e técnicas biofísicas e bioquímicas complementares. Para validação da estratégia proposta, foi produzida uma biblioteca contento mais de 100 proteínas de duas estirpes bacterianas representativas da diversidade metabólica do microbioma, Bacteroides thetaiotaomicron e Bacteroides ovatus, e a sua ligação a glicanas foi testada usando diversos microarrays. A estratégia usada levou à determinação da estrutura de 3 proteínas, sem ligando ou em complexo com os oligossacáridos identificados, incluindo: a SusD BO2743 da superfície celular de B. ovatus, envolvida na degradação de β1,3 1,4 glucanas, um tipo de glicanas provenientes da alimentação com efeito imunomodulador; e o par CBM BT3015C e SusD BT3013, pertencentes a um sistema de B. thetaiotaomicron adaptado ao reconhecimento de mucinas epiteliais do hospedeiro. Os resultados obtidos expandiram a informação disponível sobre o reconhecimento, a nível molecular, de oligossacarídeos de β-glucanas e dos cores 1/2 de O-glicanas de mucinas. Em última análise, a estratégia implementada nesta Tese pode ser estendida a outras estirpes do microbioma para ajudar a desvendar o efeito holístico do reconhecimento de glicanas no intestino humano e identificar pré- e probióticos com potencial biofarmacêutico.