Unravel the role of pericytes in endothelial cell dysfunction induced by brain metastatic breast cancer cells

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Main Author: Lopes, Maria Eduarda Fernandes
Publication Date: 2024
Format: Master thesis
Language: eng
Source: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
Download full: https://hdl.handle.net/10316/117393
Summary: Dissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de Medicina
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spelling Unravel the role of pericytes in endothelial cell dysfunction induced by brain metastatic breast cancer cellsDesvendar o papel dos pericitos na disfunção das células endoteliais induzida pelas células metastáticas cerebrais de cancro da mamaHER2+ breast cancerBrain metastasisBlood-brain barrierPericytesEndothelial cellsCancro da mama HER2+,Metástases cerebraisBarreira hematoencefálicaPericitosCélulas endoteliaisDissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de MedicinaIntroduction: The HER2+ breast cancer subtype has one of the highest incidences of brain metastases. It is well known that primary tumors prepare, in advance, the microenvironment of distant organs, creating a premetastatic niche (PMN) that supports the colonization and subsequent development of brain metastases. Brain pericytes are likely to be involved in the metastatic process due to their close association with cerebral blood vessels and their role in to maintaining the blood-brain barrier (BBB) integrity. However, the underlying mechanisms are not fully understood. Therefore, we investigated the contribution of brain pericytes to BBB dysfunction induced by HER2+ breast cancer cells during PMN formation. Materials and Methods: Secretomes (SCRs) were collected from JIMT-1 (HER2+) cells and its brain-tropic variant. The integrity of BBB was assessed by measuring the transendothelial flux of the 4kDa-FITC probe and the transendothelial electric resistance (TEER) of endothelial cells (ECs) in monoculture and in coculture with pericytes in transwells, after exposure to the SCRs. The expression of β-catenin and ZO-1 in ECs was evaluated by immunocitochemistry. Human brain vascular pericytes (HBVP) were exposed to SCRs and assessed for migratory capacity by scratch assay. Intracellular reactive oxygen species (ROS) production was measured with the H2DCFDA probe, and expression of oxidative stress and inflammatory mediators was assessed by RT-qPCR. Expression of platelet-derived growth factor receptor-αβ, p-ERK, and p-P38 was assessed by western blot. The effects of NOX4 (GLX-351322) and PDGFR-αβ (SU16F) inhibitors on pericyte ROS production, expression of inflammatory mediators and the permeability of ECs in the co-culture model was evaluated. Results: Brain pericytes contribute to the barrier properties of ECs under control conditions. Upon exposure to JIMT-1BR SCR it was observed a decrease in the properties of the BBB, as indicated by the significant increase in 4 kDa FITC permeability and decrease in TEER, and a reduction in the expression ZO-1 and β-catenin proteins. This effect was more pronounced when ECs were in co-culture with pericytes than in monoculture. Exposure to the JIMT-1BR SCRs, resulted in an increase in the migratory ability of HBVPs and in the NOX4-mediated ROS production, along with an upregulation of pro-inflammatory mediators and a trend toward increased expression of PDGFR-αβ, p-ERK and p-P38. Inhibition of NOX4, prevented the production of ROS, an effect that was more pronounced with concomitant inhibition of PDGFR signaling. PDGFR-αβ inhibition prevented the upregulation of NOX4 and the expression of pro-inflammatory mediators, and importantly prevented the ECs dysfunction induced by the JIMT-1BR SCRs in the BBB co-culture model. Conclusion: HER2+ breast cancer cells with brain tropism secret specific factors that decreased BBB permeability. Brain pericytes contributes to the loss of barrier properties of ECs through the production of ROS and proinflammatory mediators. The identification of NOX4 and PDGFR signaling as potential contributors to this process suggests a promising avenue for further exploration in therapeutic intervention.Introdução: O cancro da mama HER2+ apresenta uma das maiores incidências de metástases cerebrais. Sabe-se que os tumores primários preparam, antecipadamente, o microambiente de órgãos distantes, criando um nicho pre-mestastático (NPM) que favorece a colonização e o subsequente desenvolvimento de metástases cerebrais. Os pericitos cerebrais provavelmente estão envolvidos no processo metastático devido à sua estreita associação com os vasos sanguíneos cerebrais e ao seu papel na manutenção da integridade da barreira hematoencefálica (BHE). No entanto, os mecanismos subjacentes não são totalmente compreendidos. Portanto, investigamos a contribuição dos pericitos cerebrais para a disfunção da BHE induzida por células de cancro da mama HER2+ durante a formação do NPM. Materiais e métodos: Os secretomas (SCRs) foram colhidos a partir de células JIMT-1 (HER2+) e da sua variante cerebral. A integridade da BHE foi avaliada medindo o fluxo transendotelial da sonda 4kDa-FITC e a resistência elétrica transendotelial (TEER) das células endoteliais (CEs) em monocultura e em co-cultura com pericitos em transwells, após exposição aos SCRs. A expressão de β-catenina e ZO-1 nas CEs foi avaliada por imunocitoquímica. Os pericitos vasculares cerebrais humanos (HBVP) foram expostos aos SCRs e avaliados quanto à capacidade migratória por ensaio de scratch. A produção intracelular de espécies reativas de oxigénio foi medida com a sonda H2DCFDA e a expressão de mediadores do stress oxidativo e inflamatórios foi avaliada por RT-qPCR. A expressão do recetor do fator de crescimento derivado das plaquetas-αβ, p-ERK e p-P38 foi avaliada por western blot. Foram avaliados os efeitos dos inibidores de NOX4 (GLX-351322) e PDGFR-αβ (SU16F) sobre a produção de ROS nos pericitos, a expressão de mediadores inflamatórios e a permeabilidade das CEs no modelo de co-cultura. Resultados: Os pericitos cerebrais contribuem para as propriedades de barreira das CEs em condições de controlo. Após a exposição ao secretoma das JIMT-1BR, observou-se uma diminuição das propriedades da BHE, tal como indicado pelo aumento significativo da permeabilidade ao FITC de 4 kDa e pela diminuição do TEER, bem como uma redução da expressão das proteínas ZO-1 e β-catenina. Este efeito foi mais pronunciado quando as CEs estavam em co-cultura com pericitos do que em monocultura. A exposição ao secretoma das JIMT-1BR resultou num aumento da capacidade migratória dos HBVPs e na produção de ROS. mediada por NOX4, juntamente com a sobreexpressão de mediadores pró-inflamatórios e uma tendência para o aumento dos níveis de PDGFR-αβ, p-ERK e p-P38. A inibição da NOX4 preveniu a produção de ROS, um efeito que foi mais pronunciado com a inibição concomitante da sinalização PDGFR. A inibição do PDGFR-αβ preveniu o aumento da expressão da NOX4 e de mediadores pró-inflamatórios, e também a disfunção das CEs induzida pelo secretoma das JIMT-1BR no modelo de co-cultura da BHE. Conclusão: As células do cancro da mama HER2+ com tropismo cerebral secretam fatores específicos que aumentam a permeabilidade da BHE. Os pericitos cerebrais contribuem para a perda das propriedades de barreira das CEs através da produção de ROS e mediadores pró-inflamatórios. A identificação da NOX4 e da sinalização PDGFR como potenciais contribuintes para este processo sugere uma via promissora para uma maior exploração em intervenções terapêuticas.FCTFCT2024-02-19info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesishttps://hdl.handle.net/10316/117393https://hdl.handle.net/10316/117393TID:203769945engLopes, Maria Eduarda Fernandesinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2024-12-19T23:01:32Zoai:estudogeral.uc.pt:10316/117393Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T06:10:59.765228Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse
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