Virulence factors of non-Candida albicans Candida species
| Autor(a) principal: | |
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| Data de Publicação: | 2010 |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/1822/11196 |
Resumo: | Tese de doutoramento em Biomedical Engineering |
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Virulence factors of non-Candida albicans Candida species579.6Tese de doutoramento em Biomedical EngineeringInfections caused by Candida species (candidosis) have greatly increased over recent years, mainly due to the escalation of the AIDS epidemic, population ageing, increasing number of immunocompromised patients and the more widespread use of indwelling medical devices. Candida albicans is the main cause of candidosis, however, non-Candida albicans Candida (NCAC) species such as Candida glabrata, Candida tropicalis and Candida parapsilosis are now frequently identified as potential human pathogens. This increased incidence of NCAC in human infection can be attributed to improved identification methods but might also be a reflection of the high level of resistance often exhibited by these species to certain antifungal agents. Candida species pathogenicity is facilitated by a number of virulence factors, most importantly adherence to medical devices and/or host cells, biofilm formation, and secretion of enzymes, such as proteases. Despite intensive research to identify pathogenic factors in fungi, particularly in C. albicans, relatively little is known about the virulence determinants of NCAC species. Thus, the work described in this thesis examined several of the most relevant virulence factors (adhesion, biofilm formation ability, tissue colonisation and invasion, and expression of hydrolytic enzymes) of clinical isolates of C. glabrata, C. tropicalis and C. parapsilosis recovered from different body sites (oral cavity and urinary and vaginal tracts). The study of NCAC biofilms, in terms of formation, structure, matrix composition, and metabolic activity, was the first goal of this research. Total biomass quantification, showed that all NCAC strains were able to form biofilms, although this was less extensive for C. glabrata compared to C. parapsilosis and C. tropicalis. Scanning electron microscopy (SEM) revealed structural differences for biofilms with respect to cell morphology and spatial arrangement. Furthermore, C. parapsilosis matrices had large amounts of carbohydrates and low protein. Conversely, matrices extracted from C. tropicalis biofilms had low amounts of carbohydrates and protein. Interestingly, the composition of C. glabrata biofilm matrices' was high in both protein and carbohydrate contents. It was also evident that there were intrinsic differences in terms of metabolic activity amongst biofilms of NCAC species, and no correlation was found concerning colony forming units (CFUs) and biofilm metabolic activities determined by XTT reduction. Another objective of the work described was to study the adhesion and biofilm formation ability of several clinical urinary isolates on to silicone in the presence of artificial urine (AU) and the role of Candida surface properties (hydrophobicity and zeta potential) in these events. Silicone colonization by NCAC species in the presence of AU showed that, all urinary isolates were able to adhere to silicone, but in a species and strain dependent manner. However, these differences in adhesion could not be correlated with cell surface properties (hydrophobicity and zeta potential). Moreover, despite the high number of cultivable cells biofilms were not observed and confocal scanning laser microscopy (CLSM) showed an absence of extracellular polymeric material for all strains. The pathogenesis of C. parapsilosis and C. tropicalis was investigated using a commercially available reconstituted human oral epithelium (RHOE), in conjunction with CLSM observation and lactate dehydrogenase (LDH) determination. Furthermore, the role of secreted aspartly proteinases (Saps) on invasion and damage of RHOE was evaluated by real-time polymerase chain reaction (PCR). It was possible to observe that all C. tropicalis and C. parapsilosis strains were able to colonize the tissue, however, this was in a species- and straindependent manner. Candida parapsilosis revealed low invasiveness after 12 h of infection and extensive damage was evident after 24 h when assessed using histological examination and LDH determination. Moreover, C. tropicalis was found to be highly invasive after 12 h of infection, with extensive tissue damage occurring also after 24h. Real time-PCR of SAP genes showed that expression was strain dependent for both species. Furthermore, the results suggested that the proteinases were not involved in invasion of RHOE by C. tropicalis and C. parapsilosis, but indicated a role for these enzymes in tissue damage caused by C. parapsilosis. Finally, single and mixed infection of RHOE by C. glabrata or/and C. albicans were examined, using CLSM and peptide nucleic probes by in situ hybridization (PNA FISH). It was found that the invasiveness of C. glabrata strains was enhanced in the presence of C. albicans. In summary, this work underlines both species and strain differences in terms of virulence factors associated with C. glabrata, C. parapsilosis and C. tropicalis. Furthermore, there was clear evidence demonstrating the importance of the use of new techniques including CLSM and molecular analysis tools enabling the elucidation of the mechanisms of virulence. By increasing our knowledge on Candida pathogenesis, potential therapeutic targets may well be identified that can be used as adjuvant for new therapies.As infecções por Candida espécies (candidoses) têm aumentando drasticamente nos últimos anos, principalmente devido ao aumento da idade da população, ao crescente número de pacientes imunocomprometidos e ao elevado uso de dispositivos médicos. Candida albicans é o principal agente causador de candidoses, contudo outras espécies de Candida não albicans (CNA) têm vindo a ser identificadas como potenciais agentes patogénicos, nomeadamente, Candida glabrata, Candida tropicalis e Candida parapsilosis. Este aumento é também o reflexo da elavada resistência destas espécies a certos antifúngicos. A patogenicidade de Candida está relacionada com o elevado número de factores de virulência, sendo os mais relevantes a capacidade de aderir a materiais médicos e/ou células do hospedeiro, a facilidade em formar biofilmes e a produção de enzimas, tais como as aspartil proteases (APs). Apesar, de existirem diversos estudos desenvolvidos com o intuito de identificar factores de virulência em C. albicans, pouco se conhece sobre os factores de virulência em espécies de CNA. Assim, este trabalho teve como objectivo principal o estudo dos factores de virulência mais relevantes (adesão, formação de biofilme, colonização e invasão de tecidos, e produção de hidrolases) de vários isolados clínicos de C. glabrata, C. tropicalis e C. parapsilosis provenientes de differentes partes do corpo humano (cavidade oral e tractos vaginal e urinário). O primeiro objectivo deste trabalho foi estudar a capacidade de estirpes de CNA formarem biofilmes, bem como a sua caracterização em termos de estrutura, composição da matriz e actividade metabólica. A quantificação da biomassa total demonstrou que todas as estirpes em estudo são capazes de formar biofilme, contudo, verificou-se que C. glabrata produz menos biofilme comparativamente às estirpes de C. parapislosis e C. tropicalis. A avaliação por microscopia electrónica de varrimento revelou diferenças significativas estruturais nos biofilmes no que respeita à morfologia das células e à sua disposição espacial. A matriz dos biofilmes de C. parapsilosis apresentou elavada quantidade de polissacarídeos e baixa quantidade de proteínas. Contrariamente, as matrizes extraídas dos biofimes de C. tropicalis apresentaram reduzidas quantidades de polissacarídeos e proteínas. Curiosamente, os biofilmes de C. glabrata apresentaram elevada quantidade dos dois componentes em estudo. Com este trabalho, foi também possível concluir, que existem differenças intrínsecas em termos de actividade metabólica dos biofilmes em estudo e não foi encontrada correlação entre o número de células viáveis e a actividade celular determinada através da redução do XTT. Outro objectivo do trabalho aqui descrito consistiu no estudo da adesão e formação de biofilme de isolados urinários de CNA em silicone na presença de urina artificial (UA) e na avaliação do papel das propriedades superficiais (hidrofobiciadde e potencial zeta) das células nestes fenómenos. Estes ensaios demonstraram que todas as estirpes são capazes de aderir ao silicone, contudo com elevada variabilidade dependendo da espécie e da estirpe. Porém, os parâmetros físico-químicos das superfícies celulares avaliados não se correlacionaram com os valores de adesão obtidos. Além disso, apesar da elevada viabilidade celular após 72h, estas estirpes não foram capazes de formar quantidade elevada de biofilme, como confirmado por microscopia de confocal laser (MCL), que mostrou ausência de matriz. A patogenicidade de C. tropicalis e C. parapsilosis foi estudada em epitélio oral reconstituído (EOR) por MCL e por quantificação da libertação da enzima lactato desidrogenase. Avaliou-se também o papel das APs na capacidade invasiva e no dano causado ao epitélio por PCR em tempo real. No que respeita à infecção, foi possível verificar que todas as estirpes de C. tropicalis e C. parapsilosis foram capazes de o colonizar, contudo numa extensão que varia com a espécie e com a estirpe. Candida parapsilosis revelou-se pouco invasiva ao final de 12 h de infecção, mas causadora de elavado dano no tecido ao fim de 24 h. Por outro lado, C. tropicalis demonstrou ser altamente invasiva ao fim de 12 h e igualmente causadora de elevado dano no epitélio oral após as 24 h de infecção. Os estudos de expressão dos genes das APs, demonstram depender da estirpe para ambas as espécies. Além disso, os resultados obtidos sugerem que as APs não têm um papel activo na invasão do epitélio em C. tropicalis e C. parapsilosis, mas sugerem envolvimento no dano causado por C. parapsilosis. Por último, estudou-se a infeção simples e mista do EOR com C. glabrata e C. albicans, através de MCL e diferenciando as duas espécies com sondas de ácidos núcleicos por hibridação in situ. A co-infecção de C. glabrata com C. albicans demostrou, que a invasão de C. glabrata é favorecida por C. albicans. Assim, este trabalho mostra existirem diferenças significativas entre espécies e estirpes no que respeita aos factores de virulência de C. glabrata, C. parapsilosis e C. tropicalis. É também realçada a importância do uso de novas metodologias, tais como MCL e biologia molecular que permitam a elucidação e controlo dos mecanismos inerentes aos factores de virulência subjacentes às candidoses. O aumento do conhecimento a respeito da patogenicidade de Candida é importante uma vez que poderá permitir a identificação de potenciais alvos terapêuticos e concomitantemente, o desenvolvimento de novas terapias alternativas.Azeredo, JoanaWilliams, DavidHenriques, MarianaUniversidade do MinhoSilva, Sónia Carina2010-11-232010-11-23T00:00:00Zdoctoral thesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/1822/11196enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2024-05-11T05:25:43Zoai:repositorium.sdum.uminho.pt:1822/11196Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-28T15:18:10.813166Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse |
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