Unraveling the relevance of ARL1 GTPase in cutaneous melanoma aggressiveness

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Main Author: Saraiva, Inês Isabel Rodrigues
Publication Date: 2022
Format: Master thesis
Language: eng
Source: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
Download full: http://hdl.handle.net/10451/57182
Summary: Tese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
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spelling Unraveling the relevance of ARL1 GTPase in cutaneous melanoma aggressivenessMelanoma CutâneoAgressividadePequenas GTPasesArlsARL1Teses de mestrado - 2023Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasO Melanoma Cutâneo (MC) é um tumor que resulta de alterações genéticas nos melanócitos, sendo o cancro de pele menos comum, mas com a taxa de mortalidade mais alta devido ao seu grande potencial de metástase. A incidência do MC continua a aumentar em todo o mundo, representando um dos cancros com maior incidência em jovens adultos. O principal comportamento de risco associado ao desenvolvimento desta doença é a exposição à radiação ultravioleta, mas outros fatores como, fotótipo de pele, presença de nevos e história pessoal e familiar de MC também estão associados. No MC esporádico, as vias de sinalização MAPK e PI3K encontram-se frequentemente alteradas. A causa mais comum de desregulação da via MAPK são mutações no gene BRAF, que representa a maioria dos casos de MC, seguidas de mutações em NRAS e NF1. Mutações nestes genes resultam na ativação aberrante destas vias de sinalização, potenciando o crescimento celular, proliferação, migração, invasão e redução da apoptose, contribuindo para o desenvolvimento de MC. Nos últimos anos a utilização de terapias direcionadas a genes da via MAPK, como as terapias baseadas em inibidores BRAF e MEK, revolucionaram o tratamento dos doentes com MC. Além disso, o MC é conhecido como um tumor muito imunogénico devido à sua alta carga mutacional, e assim as imunoterapias baseadas em inibidores de checkpoint imunológico, como anticorpos anti-CTLA-4 e anticorpos antiPD-1 conferiram altas taxas de sucesso no tratamento do MC. No entanto, apesar das terapias direcionadas e imunoterapias baseadas em inibidores de checkpoint imunológico terem melhorado a sobrevida dos doentes com MC, alguns acabam por desenvolver resistência às terapias. Assim, é crucial perceber melhor os mecanismos moleculares responsáveis por esta doença e encontrar biomarcadores precisos que auxiliem no diagnóstico precoce e no desenvolvimento de novas terapias. Considerando que o funcionamento de vias de sinalização depende da ação de GTPases, que funcionam como interruptores moleculares, controlando redes de tráfego e sinalização das células, é importante explorar estas proteínas como biomarcadores em cancro, incluindo em MC. As pequenas GTPases compreendem 5 subfamílias de proteínas (RAS, RHO, RAB, RAN e ARF), que coordenam inúmeros processos celulares como, ciclo celular, proliferação celular, remodelação do citoesqueleto, tráfego membranar e migração. Sabe-se que muitas destas proteínas quando desreguladas contribuem para a progressão de diversos cancros, por exemplo, o gene RAS é um oncogene frequentemente mutado em cancros humanos e a segunda mutação mais frequente em melanoma, nomeadamente a sua isoforma NRAS. Dentro da família das ARFs, as proteínas ARL desempenham funções importantes em diversos processos celulares, tais como, migração celular, remodelação de actina e transporte vesicular, processos que podem estar associados com o desenvolvimento de cancro. De facto, a desregulação destas proteínas tem vindo a ser descrita em diversos cancros. Neste contexto, hipotetizámos que as proteínas ARL poderão ser biomarcadores precisos e alvos chave de agressividade em MC. Assim, começámos por realizar uma análise bioinformática, que mostrou que todas as ARLs se encontravam desreguladas em MC, sendo que 3 ARLs mostraram ser fatores prognósticos independentes em MC, entre as quais ARL1, ARL11 e ARL15. A expressão elevada de ARL1 mostrou estar correlacionada com sobrevida global prolongada em doentes com MC. Além disso, constatámos uma correlação significativa entre a expressão de ARL1 e a infiltração de células imunes. Sabe-se que a proteína ARL1 modula funções ao nível do complexo de Golgi e está envolvida no tráfego membranar e imunidade inata. Esta proteína foi apenas descrita uma vez em MC, nomeadamente no estudo de bioinformática do nosso grupo. Neste trabalho, investigámos se a expressão de ARL1 tem impacto na agressividade do MC. Assim sendo, os objetivos deste trabalho passaram por, avaliar a expressão de ARL1 na cohort de MC do IPOLFG, perceber se ARL1 está associada com o sistema imunitário e compreender a relevância de ARL1 na agressividade do MC in vitro ao nível da migração celular, invasão e metabolismo. A expressão de ARL1 foi avaliada em amostras cirúrgicas de doentes com MC por RT-qPCR, comparando: 1) pele normal e MC; 2) estágio; 3) tipo de amostra; 4) estado mutacional de BRAF. Além disso, as amostras cirúrgicas, bem como amostras de sangue de doentes com MC foram analisadas para avaliar a correlação da expressão de ARL1 com diversas populações imunes (linfócitos T citotóxicos, linfócitos T auxiliares, linfócitos T reguladores, monócitos e macrófagos) infiltradas no tumor e em circulação por citometria de fluxo. Para os ensaios in vitro, silenciámos ARL1 nas linhas celulares de MC, A375 e WM115. A confirmação do silenciamento foi realizada ao nível do mRNA por RT-qPCR e ao nível da proteína por western blot. Posteriormente, verificámos se o silenciamento de ARL1 afetou a viabilidade celular através de dois ensaios, trypan blue e CCK8. Para determinar o impacto de ARL1 na agressividade do MC, avaliámos a capacidade migratória e invasiva das linhas celulares A375 e WM115 silenciadas para ARL1 através de ensaios de migração e invasão. A interação de ARL1 com as vias de sinalização MAPK e PI3K foi investigada por western blot. Por fim, avaliámos se ARL1 é capaz de influenciar o metabolismo celular do melanoma através de um painel de diferentes genes envolvidos em vias metabólicas por RT-qPCR. Até ao momento, os nossos resultados mostram que não existem diferenças na expressão de ARL1 entre amostras de MC e pele normal, nem com o estágio, tipo de amostra e o estado mutacional de BRAF. Encontrámos uma correlação positiva entre a expressão de ARL1 e a infiltração de linfócitos T auxiliares, linfócitos T citotóxicos e expressão de CCR4 em células T reguladoras. Relativamente aos resultados in vitro, o silenciamento de ARL1 não afetou a viabilidade celular das linhas celulares A375 e WM115. No entanto, levou a uma diminuição na migração celular na linha A375, mas sem afetar a capacidade de migração da linha WM115. Não foram verificadas diferenças significativas na invasão celular para ambas as linhas de MC. Os nossos resultados indicam que níveis mais baixos de ARL1 diminuem e aumentam a ativação da via MAPK nas células A375 e WM115, respectivamente. O silenciamento de ARL1 parece diminuir os níveis de proteína AKT na via PI3K nas células A375, mas não vimos diferenças na linha WM115. Finalmente, in vitro ARL1 não parece interferir com a expressão de genes ligados à produção de lactato (LDHA, LDHC, MCT1 e MCT4), via das pentoses fosfato (G6PD) e síntese de aminoácidos (GLS1, SNAT1, SNAT2, XCT e EAAT3). Neste trabalho, conseguimos caracterizar o efeito da expressão de ARL1 na cohort de MC do IPOLFG, não tendo detectado diferenças entre MC e pele normal ao nível da expressão de ARL1. ARL1 parece ser capaz de modular o sistema imune através de uma atividade imunossupressora e antitumoral. Os nossos dados indicaram ainda, que o silenciamento de ARL1 não afetou a viabilidade celular, nem a invasão celular para ambas as linhas de MC. A migração celular diminuiu na linha celular A375 silenciada para ARL1 comparativamente ao controlo. Assim, altos níveis de ARL1 parecem aumentar a agressividade do MC. Estes resultados foram apoiados pela diminuição da ativação da via MAPK. No entanto, não encontrámos diferenças significativas na migração celular da linha WM115, mas o silenciamento de ARL1 parece aumentar a ativação da via MAPK. Portanto, ARL1 poderá desempenhar um papel controverso. Não encontrámos relação entre o silenciamento de ARL1 e o metabolismo do MC.Cutaneous melanoma (CM) is the skin cancer with the highest mortality rates due to its great potential for metastasis. The incidence of CM continues to increase worldwide, and its biology remains poorly understood. In addition, not all patients respond to current therapies. Therefore, it is crucial to better understand the molecular mechanisms responsible for this disease and find precise biomarkers that help in early diagnosis, prognosis and development of new therapies. In this context, we hypothesized that ARL proteins could be CM biomarkers and aggressiveness key targets. Furthermore, ARLs play an essencial role in several cellular processes (e.g. cell migration, actin remodeling and vesicle transport) that may impact cancer progression. In particular, the involvement of ARL1 in membrane traffic and innate immunity was only described once in CM. In a bioinformatics study performed by our group, high expression of ARL1 was correlated with prolonged overall survival of CM patients and higher infiltration of immune cells. Here, we investigated ARL1 expression in the Instituto Português de Oncologia de Lisboa Francisco Gentil (IPOLFG) CM cohort and assessed the relevance of ARL1 in CM aggressiveness in vitro. ARL1 expression was evaluated in surgical samples from CM patients by RT-qPCR, and the correlation of ARL1 expression with various immune subsets was detected by flow cytometry. Additionally, transwell migration and invasion assays were performed with A375 and WM115 CM cell lines to determine the impact of ARL1 on CM aggressiveness. Western blot evaluated the interaction of ARL1 with the MAPK and PI3K pathways, and RT-qPCR evaluated the relationship of ARL1 knockdown with different genes involved in cellular metabolism. Thus far, our results showed no differences in ARL1 expression between CM samples and normal skin, as well as according to the stage, sample type and BRAF mutational status. We found a positive correlation between ARL1 expression in the tumor and infiltration of helper T lymphocytes, cytotoxic T lymphocytes and CCR4 expression in regulatory T cells. Regarding the in vitro results, ARL1 knockdown did not affect the cell viability of A375 and WM115 cell lines. However, it decreased the A375 CM cell lines’s cell migration, while harboring no effect on WM115 migration capability. No significant differences were verified in cell invasion for both CM cell lines. Our results indicate that lower levels of ARL1 decreases and increases the activation of the MAPK pathway in A375 and WM115 cell lines, respectively. In addition, ARL1 knockdown appears to decrease AKT protein levels in the PI3K pathway in A375 cell line. Finally, in vitro ARL1 does not seem to interfere with expression of genes linked to lactate production (LDHA, LDHC, MCT1 and MCT4), pentose phosphate pathway (G6PD) and amino acid synthesis (GLS1, SNAT1, SNAT2, XCT and EAAT3). Here, we could characterize ARL1 expression in a CM cohort from IPOLFG, and we have not seen differences between CM and normal skin. ARL1 has been shown to have an immunosuppressive and antitumor role. Our data further indicate that ARL1 knockdown altered A375 cell migration, suggesting that high levels of ARL1 may increase CM aggressiveness, but we found no differences in invasiveness in two distinct cell lines. We verified that ARL1 is involved in the MAPK and PI3K pathways in both CM cell lines, but we found no relationship between ARL1 silencing and CM metabolism.Sousa, Marta Sofia PojoMoreira, Rita Maria Pulido Garcia Zilhão AranhaRepositório da Universidade de LisboaSaraiva, Inês Isabel Rodrigues2023-04-18T16:42:09Z202320222023-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/57182TID:203492374enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2025-03-17T14:56:14Zoai:repositorio.ulisboa.pt:10451/57182Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T03:29:20.915854Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse
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