Patterns of suberization in root tissues of Arabidopsis thaliana mutants

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Main Author: Cavaco, Manuel Martins
Publication Date: 2022
Format: Master thesis
Language: eng
Source: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
Download full: http://hdl.handle.net/10451/56537
Summary: Tese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
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spelling Patterns of suberization in root tissues of Arabidopsis thaliana mutantsSuberinaPeridermeSTIMPYTeses de mestrado - 2023Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasSuberin is a complex hydrophobic biopolymer found deposited in the bark of trees, which protects the tree by reducing water loss, regulating gas exchanges and from pathogens attacks. An extreme example of suberin deposition can be found in the bark (cork) of Quercus suber trees. In the root tissues, suberization also occurs, protecting the root from biotic/abiotic stresses. There are mainly two suberized tissues in the Arabidopsis roots: the endodermis, which differentiates inwards to the cortex, close to the root apical meristem, and progresses along the root axis giving rise to another tissue, the periderm, a protective outer tissue more prominent at the root-hypocotyl border. Recently, a transcriptomic study revealed several promising candidate genes to be exclusively involved in cork differentiation in cork oak. However, the role of the candidates in the suberization process of tissues is yet to be explored. By making use of the Arabidopsis simpler model system, the loss of function mutants for the for the homolog candidate genes was analyzed as o their endoderm and periderm development phenotypes. To investigate if the changes observed in the mutants were caused by alterations in suberin deposition patterns during primary growth at initial stages of endodermis development, the root patterns of suberization were analyzed by fluorescence microscopy using the fluorescent Fluorol Yellow 088 stain to seven-day old wild-type and mutant seedlings. Mutations in three of the candidate genes (WOX9/STIMPY, ANT and MYB36) led to alterations in suberin formation during developmental progression of the primary root endodermis. We found that especially WOX9/STIMPY, a homeobox gene required for shoot apical meristem growth, could be implicated in the differentiation of suberin in the endodermis. By examining the suberization patterns of the root endodermis of gain and loss of WOX9 function mutants’ results showed that while stip-1 and stip-2, the WOX9 loss-of-function alleles show delayed suberization of the endodermal cells, the gain-of-function mutant, stip-D, shows the opposite effect, when compared to the wild-type genetic background. Additionally, we performed expression analysis to genes encoding proteins of the suberin biosynthesis and deposition pathway in the WOX9 gain- and loss-of-function mutants, by quantitative real time-PCR to root-hypocotyl tissues. The gene expression data revealed that the anatomical defects observed in stip-1 are accompanied by the decrease in the steady-state mRNA transcript levels of FAR1, ASFT, CYP86A1, CYP86B1, KCS2, GPAT5, ABCG6 and GELP38 genes, hence, of all suberin-related genes that are representative of the suberin pathway, tested in this work. These results indicate that WOX9 might be operating in the suberin regulatory pathway well upstream of the biosynthetic pathway. Furthermore, to understand whether defects on endodermal suberization of the mutants were downstream of ABA we tested whether the exogenous application of ABA could rescue the stip-1 mutant phenotype. Indeed, 24h after ABA treatment, defects in stip-1 were partially overcome by ABA-induced suberization in the endodermal cells, suggesting WOX9 might operate upstream of ABA biosynthesis/signalling or bypass the pathway. These results., together with preliminary phylogenetic analysis to WOX9, point towards a possible regulatory role for WOX9 gene during the suberization process, and we hypothesize on its positioning in existing regulatory pathways.A Suberina, que é um polímero hidrofóbico complexo encontra-se presente na casca de árvores, e desempenha diversas funções protetoras da planta, tendo papéis importantes na redução da perda de água por transpiração, na regulação de trocas gasosas e na proteção contra outros organismos potencialmente patogénicos. Um exemplo extremo da capacidade de deposição de suberina pode ser encontrado na casca do sobreiro (Quercus suber). Mas a suberina não é exclusiva dos troncos das árvores. Nas raízes de Arabidopsis thaliana também ocorre a deposição de suberina, conferindo à planta proteção contra stresses bióticos e abióticos. Nas raízes desta herbácea existem essencialmente dois tecidos suberizados: a endoderme, que se diferencia no centro do córtex, e que que se encontra perto do meristema apical radicular, cujo tecido se vai diferenciando ao longo do eixo da raiz até originar um outro tecido também suberizado, a periderme, que é o tecido protetor mais externo e que é mais proeminente na região de transição entre a raiz e o hipocótilo. Recentemente, um estudo de transcriptómica realizado no laboratório de acolhimento revelou vários genes candidatos promissores que poderão estar envolvidos na diferenciação da cortiça em sobreiro. No entanto, a função destes candidatos no processo de suberização ainda se mantém inexplorada. Usando a Arabidopsis como um modelo de estudo mais simples que o sobreiro, analisaram-se os mutantes de perda de função dos respetivos homólogos dos genes candidatos, mais especificamente, estudou-se o desenvolvimento da endoderme e da periderme. Para investigar se as alterações observadas nos mutantes eram causadas pelas alterações nos padrões de deposição da suberina durante o desenvolvimento primário, ou seja, durante as primeiras fases de desenvolvimento da endoderme, analisaram-se os padrões de suberização, na raiz, através de microscopia de fluorescência e usando um corante fluorescente (Fluorol Yellow 088), aplicado a plântulas com sete dias após germinação. Alguns trabalhos anteriores têm usado esta metodologia para estudar o envolvimento de genes candidatos no processo de suberização, estudando o impacto que possuem nas três zonas principais de suberização que estão presentes ao longo da raiz: em primeiro lugar, mais próximo do meristema apical da raiz existe uma zona não suberizada, onde não existem células da endoderme suberizadas; seguida de uma zona “patchy”, onde começa o aparecimento gradual de células suberizadas; e por último, uma zona contínua onde todas as células da endoderme se encontram totalmente suberizadas formando um anel contínuo que compõe a periderme. Analisando os perfis de suberização nos mutantes, observámos que as mutações em três genes candidatos (WOX9/STIMPY, ANT e MYB36) revelaram alterações na formação da suberina durante o desenvolvimento da endoderme, na raiz, relativamente aos controlos do tipo selvagem. Os restantes mutantes para os genes MYB84, ATHB6 e CLV1 não apresentaram diferenças significativas relativamente aos controlos, no entanto, não se sabe se podem influenciar a via da suberina alterando a composição química da mesma. Neste trabalho que apresentamos, foi evidenciado que o gene WOX9/STIMPY, que é essencial para o crescimento do meristema apical, poderia estar implicado na diferenciação da suberina na endoderme. Examinando os padrões de suberização nos mutantes de ganho e perda de função do WOX9, os resultados mostraram que enquanto os alelos de perda de função, stip1 e stip-2, mostram ter um atraso na suberização das células da endoderme relativamente aos controlos, o alelo de ganho de função, stip-D, manifesta o efeito contrário, quando comparado com o fundo genético do tipo selvagem e Col-0. A mutação de perda de função do gene ANT manifestou um fenótipo muito semelhante ao dos mutantes de perda de função WOX9, levando ao aumento da percentagem de células da endoderme na região patchy. O mutante de perda de função do factor de transcrição MYB36 manifestou um aumento na percentagem de células suberizadas, o que sugere que o MYB36 possa atuar como um regulador negativo do processo de suberização. Alguns trabalhos anteriores obtiveram padrões de deposição de suberina em mutantes myb36 fenótipos semelhantes aos obtidos neste trabalho. Tendo em conta estes resultados, foi feita uma análise de expressão, em genes que codificam enzimas envolvidas na síntese e deposição da suberina, em mutantes de ganho e perda de função do WOX9, através de PCR quantitativo em tempo real usando tecidos da raiz e do hipocótilo. Os dados referentes à expressão destes genes revelaram que os defeitos anatómicos observados anteriormente no stip-1 foram acompanhados pela descida dos níveis de transcritos dos genes FAR1, ASFT, CYP86A1, CYP86B1, KCS2, GPAT5, que estão envolvidos na biossíntese dos monómeros que compõe a suberina; do gene ABCG6 e do GELP38, que estão envolvidos no transporte membranar e polimerização da lamela, respetivamente. Todos os genes representativos da via da suberina que foram testados nesta análise mostraram alterações relevantes relativamente à expressão nos controlos tipo selvagem. Estes resultados indicam que o WOX9 poderá operar na via regulatória da suberina a montante da via de biossíntese. O mutante de ganho de função, o stip-D não revelou diferenças significativas nos níveis de expressão da grande maioria dos genes da via da suberina, quando comparado com o controlo. Isto é indicativo que a atividade do WOX9 poderá ser reprimida por outros genes reguladores da via da suberina. Estudos prévios indicam que este gene poderá atuar reprimindo outros fatores de transcrição, pelo que seria interessante realizar, no futuro, um estudo de expressão semelhante, no entanto, com genes referentes aos principais fatores de transcrição envolvidos no processo de regulação da suberina. Para explorar se estes defeitos observados nos mutantes estariam a jusante da via do ácido abscísico (ABA), testámos se a aplicação exógena de ABA reverteria o fenótipo observado no mutante de perda de função, o stip-1. Após 24 horas da aplicação exógena de ABA, os defeitos observados na suberização nos mutantes foram parcialmente recuperados através da indução da suberização mediada pelo ABA, sugerindo que o WOX9 poderá operar a montante da via de sinalização do ABA. Para explorar mais esta relação, deveria ser feito um estudo de expressão envolvendo os principais genes reguladores da via do ABA. Posteriormente foi feita uma análise filogenética por forma a explorar a história evolutiva destes genes candidatos e de forma e desmistificar qual poderá ter sido o seu envolvimento na colonização terrestre, por parte das plantas. Foram selecionadas nove espécies, previamente utilizadas em estudos referentes à origem evolutiva da suberina, de forma a representar três grandes grupos (Algas, Plantas-não-vasculares e Plantas Vasculares). A presente análise revelou a relevância de certos candidatos no processo da colonização terrestre. Tendo em conta os resultados obtidos nos ensaios anteriores, foi feito um aprofundamento na história evolutiva do gene WOX9 que revelou evidências de este estar envolvido em processos regulatórios nas primeiras plantas vasculares, porém a família deste gene revelou estar presente nas algas em fases mais precoces do processo de colonização terrestre, pelas plantas. Durante a análise histológica surgiram estruturas que eram indicativas de serem artefactos, no entanto o contrário foi posteriormente aprofundado. Em todos os genótipos, encontraram-se células únicas não suberizadas presentes em regiões completamente suberizadas e diferenciadas, parecendo tratar-se de um artefacto histológico, no entanto, trabalhos anteriores teriam já identificado estas estruturas como sendo células de passagem. Apesar de não se conhecer totalmente a sua função, admitese a hipótese de estas células poderem ser pontos de interações bióticas e abióticas. Dada a ausência de suberização deduz-se que estas estruturas possam ser úteis, para no futuro construir uma linha marcadora repórter da expressão do WOX9 para explorar a possível função reguladora deste gene no processo de suberização, ou até mesmo de outros genes candidatos. O factor de transcrição WOX9 parece atuar numa via de sinalização complexa muito pouco explorada, onde as funções de muitos dos genes envolvidos não foram ainda esclarecidas. As hipóteses que foram colocadas parecem elucidar alguns aspetos desta via, no entanto, futuros trabalhos devem aprofundar as alterações observadas no presente estudo.Milhinhos, Ana Filipa GonçalvesMiguel, Célia Maria Romba RodriguesRepositório da Universidade de LisboaCavaco, Manuel Martins2023-03-03T16:46:06Z202320222023-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/56537TID:203492463enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2025-03-17T14:54:34Zoai:repositorio.ulisboa.pt:10451/56537Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T03:28:45.713664Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse
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