Estudo das interações entre intercaladores e pDNA para terapia molecular

• Main Author: Proenca, Zelia Patricia Cordeiro
• Publication Date: 2014
• Format: Master thesis
• Language: por
• Source: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
• Download full: http://hdl.handle.net/10400.6/6177
• topic: Cromatografia de Afinidade; Dna Plasmídico; Intercaladores de Dna.; Ligandos de Afinidade; Rmn-Std; Rps; Terapias Moleculares

Nas últimas décadas o desenvolvimento da terapia genética e a produção de vacinas de DNA têm sido promissores para tratar e controlar determinadas patologias através da transferência de genes. O DNA plasmídico (pDNA) tem sido utilizado como vetor não viral com intuito terapêutico, nomeadamente a conformação superenrolada (sc). Têm sido propostas várias metodologias para a sua purificação, nomeadamente processos baseados na cromatografia de afinidade (AC), pois esta é considerada específica para a separação da isoforma sc, através do reconhecimento bioespecífico do ligando imobilizado. O presente estudo descreve a síntese e caracterização de ligandos aromáticos derivados de naftaleno e piridina e posterior imobilização na matriz Sepharose®. A caracterização do suporte ligando A-Sepharose® foi realizada por ressonância magnética de alta resolução de ângulo mágico (HR-MAS RMN) de modo a avaliar se o ligando foi covalentemente ligado à matriz. A afinidade entre os ligandos, 3,8-diamino-6-fenilfenantridina (DAPP), ligando A e ligando D e as isoformas do plasmídeo pVAX1-LacZ (sc e linear (ln)) foi determinada por ressonância plasmónica de superfície (RPS). A caracterização das interações biomoleculares entre os suportes ligando A e DAPP e os mononucleótidos foi realizada por ressonância magnética nuclear - diferença de transferência de saturação (RMN-STD). Os resultados de RMN-STD mostram que o 5'-CMP e os 3'- 5'-AMP interagem com os suportes DAPP-Sepharose® e ligando A-Sepharose®, preferencialmente pelas bases, sugerindo empilhamento p-p entre os anéis aromáticos dos ligandos e os mononucleótidos. O 5'-TMP interage preferencialmente pelo grupo metilo sugerindo interações hidrofóbicas com ambos os suportes. Contrariamente, o 5'-GMP interage com o suporte DAPP-Sepharose® pela desoxirribose sugerindo interações hidrofóbicas e de van der Waals. Através da análise por RPS verificou-se que o ligando DAPP interage apenas com as isoformas (sc e ln) na presença do tampão acetato de sódio 10 mM a pH 5 e às temperaturas 10° C e 25 °C. Verificou-se ainda, que o ligando A apresenta maior afinidade em Tris-HCl (KD=8,65x10-8±1,0x10-8 M) a 25 °C para a isoforma sc, enquanto que o DAPP tem maior afinidade em acetato de sódio (KD=5,77x10-9±3,1x10-9 M) a 25 °C para a isoforma ln. Relativamente ao ligando D, verificou-se que às temperaturas 10° C e 25 °C não há diferença significativa na afinidade para as duas isoformas. Deste modo os resultados apresentados sugerem que o ligando A é promissor para ser utilizado em AC na purificação de plasmídeos.