Comparative genomics in brucella suis : from intra-specific and inter-specific distinctive features to diagnostic molecular markers
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| Language: | eng |
| Source: | Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) |
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Summary: | Tese de doutoramento, Biologia (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017 |
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Comparative genomics in brucella suis : from intra-specific and inter-specific distinctive features to diagnostic molecular markersTeses de doutoramento - 2017Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de doutoramento, Biologia (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017Brucella suis is divided into five biovars of which only biovars 1, 2 and 3 infect Suidae. Biovars 1 and 3 cause severe disease in humans and are mainly prevalent in South America and South-East Asia. In contrast, biovar 2 has been rarely isolated from humans, and its zoonotic role is questioned. Currently, B. suis biovar 2 is the unique biovar isolated in Portugal and Spain, representing an emerging disease in domestic swine throughout Europe, being associated with the increase of extensive pig farms and the high density of infected wild boars (Sus scrofa). In the present work the genetic structure of a collection of B. suis strains was characterized. Molecular fingerprinting with restriction enzymes and Variable Number Tandem Repeats (VNTR) showed differences between strains from Iberian Peninsula and others from Central Europe. The majority of strains isolated in Portugal and Spain share specific molecular characteristics establishing an Iberian clonal lineage. However, strains isolated from wild boars in the North-East region of Spain were similar to those isolated in other Central-European countries. In order to deeply understand genomic differences between Iberian and Central-European clones and further unveil B. suis pan-genome and evolutive history, the genomes of five B. suis biovar 2 strains isolated from wild boars and representative of both clonal lineages circulating in Iberian Peninsula were sequenced and compared with 18 publicly available sequenced genomes from eight of the 12 recognized Brucella species. This full genome comparative analysis showed that Brucella is a highly conserved genus with two chromosomes and apparently slow evolutionary rates at species level. Nevertheless, B. suis biovar 2 strains from Iberian clonal lineage can be differentiated from those from Central-European clonal lineage not only by the presence of one large inversion in Chromosome I but also by a number of specific SNPs, deletions and insertions. Furthermore, 10 different target-PCRs protocols were established and validated for the differentiation of strains from a specific clonal lineage, being useful to be used as epidemiological markers for future investigations. The mutational enrichment of Iberian lineage was associated to genes encoding membrane proteins described with potential of interaction with external stimulus, as well as to genes with impact on the metabolism of the pathogen. The genomic specialization and local adaptation of B. suis biovar 2 strains establish an Iberian ecovar, raising an important question regarding the mechanisms responsible for putative tropisms as response to adaptation to a specific host and/or pathobiological conditions. Future work should be done to better understand the consequences of these disarrangements and their impact in pathogenicity or virulence in wide range of hosts, including man.A brucelose em suínos é uma infecção causada por Brucella suis. Esta espécie apresenta cinco biovares, sendo a infecção em suínos causada apenas pelos biovares 1, 2 e 3. Os biovares 1 e 3 são patogénicos para o homem e prevalecem sobretudo na América do Sul e Sudeste da Ásia. O biovar 2 não é patogénico para o homem e é enzoótico nas populações de javalis (Sus scrofa) e lebres (Lepus europaeus) do Norte, Centro e Sudeste da Europa, sendo estes animais silváticos os agentes transmissores da infeção aos suínos. De facto, a brucelose devida ao biovar 2 representa uma doença emergente em suínos domésticos em toda a Europa e está associada ao aumento de explorações extensivas e à alta densidade de javalis infetados, representando um perigo importante especialmente para a população de porcos ibéricos criados em sistemas extensivos. Na Península Ibérica, o biovar 2 é o único biovar isolado em porcos e javalis. Apesar da escassez de estudos para compreender as relações epidemiológicas e a filogenia deste agente patogénico, a tipificação molecular baseada em polimorfismos no tamanho de fragmentos de hidrólise com enzimas de restrição (RFLPs) de genes codificantes de proteínas da membrana externa (Omp2a, Omp2b, Omp31) e em variações no número de repetições em tandem em regiões micro- ou minissatélites do genoma (VNTRs) mostraram diferenças entre as estirpes da Península Ibérica e as da Europa Central. Assim, o trabalho desenvolvido ao longo desta tese visou aumentar o conhecimento das estirpes de B. suis biovar 2 que circulam na Europa e, em particular, em Portugal, bem como evidenciar variações genómicas associadas a estirpes de origem geográfica específica. Em Portugal, o diagnóstico bacteriológico da brucelose é apenas realizado no Laboratório de Bacteriologia e Micologia da Unidade Estratégica de Produção e Saúde Animal do Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária (INIAV, IP). No entanto, este diagnóstico está especialmente focado no isolamento de B. abortus e B. melitensis na sequência das campanhas de controlo e erradicação da brucelose em bovinos e pequenos ruminantes. Relativamente aos suínos, não é efetuada qualquer vigilância sistemática, desconhecendo-se a prevalência da infeção em Portugal. Os estudos efetuados neste trabalho visaram alargar o conhecimento sobre a diversidade genética das estirpes de B. suis biovar 2 que circulam em Portugal. Inicialmente foi desenvolvido e avaliado um meio seletivo, LNIV-M, que foi formulado utilizando antibióticos menos inibitórios, permitindo aumentar a sensibilidade do diagnóstico bacteriológico e aumentar o número de isolados de B. suis. Uma vez que o conhecimento das estirpes predominantes é um pré-requisito para qualquer estudo epidemiológico, foram aplicados diferentes métodos moleculares a uma coleção de isolados de B. suis, que incluiu não só os isolados de Portugal como também de outros países europeus. Foram identificados cinco perfis de restrição (haplótipos) entre os isolados de biovar 2, com dois haplótipos específicos restritos a Portugal e Espanha (2d e 2e). Os três haplótipos restantes (2a, 2b e 2c), encontram-se disseminados pela Europa (exceto na Península Ibérica). A diversidade genética da população de B. suis foi determinada pela análise do número variável de repetições em tandem em múltiplos locais do genoma, vulgarmente designada por MLVA. O ensaio de MLVA aplicado à genotipificação de estirpes de Brucella spp. utiliza um conjunto de 16 VNTRs que estão distribuídos por três painéis: painel 1, composto por oito minissatélites, painel 2A e painel 2B, compostos respetivamente por três e cinco microssatélites. A análise alocou os isolados de biovar 2 em dois clusters de acordo com as suas origens geográficas e haplótipos, definindo assim uma linhagem clonal ibérica (Portugal e Espanha) e uma linhagem clonal Central-Europeia. A análise de 350 estirpes adicionais de todas as biovariedades de B. suis revelou ainda uma elevada divergência genética entre as estirpes com base nos seus hospedeiros, realçando a estreita relação entre as estirpes de suínos, javalis e lebres. Além de corroborar a existência das duas linhagens clonais de biovar 2, os resultados obtidos sugerem que a evolução da linhagem clonal Ibérica ocorre devido a um evento de especiação alopátrica. Para comparar a estrutura genómica e avaliar a diversidade genética entre as estirpes de B. suis biovar 2, foram construídos os mapas ópticos de cinco estirpes de campo isoladas de javalis e representativas das linhagens clonal Ibérica (PT09143, PT09172, Bs143CITA) e Central-Europeia (Bs364CITA, Bs396CITA), bem como da estirpe de referência B. suis biovar 2 ATCC 23445 (linhagem Central-Europeia, origem: Dinamarca), utilizando a tecnologia Optical Mapping (mapeamento óptico). Cada estirpe apresentou um perfil único de restrição, de 228 a 232 fragmentos, distribuídos pelos dois cromossomas, tendo-se observado baixa divergência no cromossoma II (1,6%) relativamente ao cromossoma I (2,4%). O mapeamento óptico revelou no cromossoma I a presença de um evento de inserção-deleção (INDEL, 3,5 kb) específico da estirpe de referência ATCC 23445, e uma grande inversão (944 kb) exclusiva da linhagem clonal Ibérica. Além de validar a existência de uma inversão na linhagem clonal Ibérica, reforçando a plasticidade genómica de Brucella spp., os mapas ópticos permitiram também determinar o posicionamento e a orientação das sequências consenso (contigs), agilizando o processo de montagem e finalização dos genomas. Assim, as sequências genómicas completas e anotadas, das cinco estirpes de B. suis biovar 2 referidas anteriormente, foram prontamente obtidas utilizando-se uma estratégia que combinou: (1) a sequenciação das estirpes, utilizando a plataforma de sequenciação de nova geração (NGS), Illumina HiSeq 2000; (2) a re-sequenciação, por Sanger, das regiões de baixa qualidade ou contendo bases ambíguas; (3) a montagem de novo e finalização dos genomas guiada por Optical mapping. À semelhança do genoma da estirpe de referência de B. suis biovar 2, os cinco genomas sequenciados neste trabalho são compostos por dois cromossomas circulares (Chr I e Chr II) com aproximadamente 1,93 e 1,40 Mb. Em média o teor GC (%) dos Chr I e Chr II foi de 57,1% e 57,3%, respetivamente. Os cinco genomas contêm três operões idênticos de genes de RNA ribossomal (rRNA), um localizado no Chr I e dois no Chr II. Todos os genomas possuem 54 genes de RNA de transferência (tRNA). O número de regiões codificantes (CDS) foi estimado tendo por base a homologia e a identificação dos domínios funcionais das proteínas, que variaram de 3 014 (PT09143) a 3 027 (Bs396CITA) e o número de pseudogenes entre 87 (Bs396CITA) e 91 (Bs364CITA). A fim de melhor compreender os mecanismos envolvidos na evolução e especialização das linhagens Ibéricas, foi realizada uma análise genómica comparativa entre os cinco genomas de B. suis biovar 2 e os 18 genomas disponíveis nas bases de dado públicas, incluindo oito espécies de Brucella. A análise efetuada confirmou que o género Brucella é altamente conservado, com dois cromossomas e taxas de evolução aparentemente lentas a nível de espécie. No entanto, as estirpes de B. suis biovar 2 da linhagem clonal Ibérica foram diferenciadas da Central-Europeia não só pela presença de uma grande inversão no Chr I, mas também por um conjunto de polimorfismos de base única (SNPs) e deleções-inserções (INDELs) específicas. Estes resultados permitiram desenvolver e validar diferentes protocolos de PCR para 10 regiões polimórficas com potencial epidemiológico para a diferenciação das estirpes de uma linhagem clonal específica. Foi ainda observado que o enriquecimento mutacional da linhagem Ibérica está associado a genes que codificam proteínas de membrana, bem como a genes com impacto no metabolismo deste agente patogénico. No entanto, outros estudos são necessários para compreender melhor as consequências destas variações genómicas e o seu impacto na patogenicidade ou virulência numa ampla gama de hospedeiros, incluindo o Homem. Em conclusão, com este trabalho foi demonstrado que existem duas linhagens clonais de B. suis biovar 2 a circular na Europa, sendo que a especialização genómica e adaptação local das estirpes pertencentes à linhagem clonal Ibérica estabelecem um ecovar Ibérico, levantando uma importante questão sobre os mecanismos responsáveis por tropismos putativos como resposta à adaptação a um hospedeiro específico e/ou condições patobiológicas.Biosystems and Integrative Sciences Institute (BioISI); FCT/MCTES/PIDDACTenreiro, Rogério Paulo de Andrade, 1955-Sá, Maria Inácia Aleixo Vacas de Carvalho Corrêa deRepositório da Universidade de LisboaInácio, Ana Cristina Ribeiro Alves Ferreira, 1973-2017-12-21T15:02:24Z201720172017-01-01T00:00:00Zdoctoral thesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/30171TID:101406053enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2025-03-17T13:45:24Zoai:repositorio.ulisboa.pt:10451/30171Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T02:53:09.944060Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse |
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