Desenvolvimento e validação de um sistema high-throughput de irradiação EBRT para estudos de radiobiologia in vitro.

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Main Author: Franco, Pedro Daniel Ferreira
Publication Date: 2024
Format: Master thesis
Language: por
Source: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
Download full: https://hdl.handle.net/10316/118008
Summary: Dissertação de Mestrado em Física Médica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia
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spelling Desenvolvimento e validação de um sistema high-throughput de irradiação EBRT para estudos de radiobiologia in vitro.Development and validation of a high-throughput EBRT irradiation system for in vitro radiobiology studies.Metastatic prostate cancerExternal beam radiation therapy (EBRT)Intensity modulated radiation therapy (IMRT)PhantomCancro da próstata metastáticoRadioterapia de fonte externaRadioterapia de intensidade moduladaFantomaDissertação de Mestrado em Física Médica apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaProstate cancer is one of the most common types of cancer and has the sixth highest mortality rate worldwide. Current therapeutic options for this disease include surgery, chemotherapy, hormonal therapy, and external beam radiation therapy (EBRT). Radiation therapy is one of the most widely used cancer treatments and involves irradiating the tumor site with ionizing radiation to induce an anti-tumor effect through the formation of single and/or double-strand DNA breaks. Despite advancements in the modalities and equipment used in external beam X-ray radiation therapy, limitations still exist in the understanding of the biological effects associated with this type of treatment, which could be utilized for more personalized planning and treatment. In radiobiology, survival curves obtained through clonogenic assays in two-dimensional (2D) cultures are the standard method for studying the cellular response to radiation. However, these 2D models do not replicate the typical tumor architecture. To address this limitation, spheroid (3D) cellular models have gained popularity because they more accurately represent dynamic tumor architecture. Additionally, there is a need for studies using irradiation systems that closely mimic clinical conditions, to enhance the clinical translation of the results obtained.Thus, the main objective of this dissertation was to develop an efficient irradiation system for preclinical cellular models, with high clinical translatability, enabling the irradiation of prostate cancer cells in both 2D and 3D cultures. The secondary objective was to optimize the irradiation protocol to ensure reproducible positioning and conditioning, in order to study the underlying mechanisms of cellular response to external beam radiation therapy.Initially, a phantom was developed from a material with a density similar to water (epoxy resin), with dimensions of 30×30 cm and a thickness of 5 cm. This phantom was composed of two parts: an external part, which filled the space surrounding the culture plates, and an internal part, which filled the air gaps found in the lower part of the culture plates. Subsequently, a radiation therapy plan was developed, starting with the acquisition of computed tomography (CT) images of the phantom, followed by the optimization of intensity-modulated radiation therapy (IMRT) plans to cover doses of 0.25 Gy, 0.50 Gy, 0.75 Gy, 1 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 5 Gy, 6 Gy, 8 Gy, and 10 Gy for each 6-well and 96-well culture plate. Finally, PC3 cells were irradiated in both 2D and 3D cultures. To validate the developed irradiation method, the biological effects induced by X-ray exposure in these cell cultures were assessed. For this purpose, cell survival was evaluated 8 days after irradiation in both 2D cultures and 3D (spheroid) cultures using the clonogenic assay, which allows for the assessment of the cells' ability to form colonies and survive in the long term. In addition, the viability of the spheroids (3D) was assessed 7 days after irradiation using the CellTiter-Glo® assay, which quantifies intracellular ATP levels.The results demonstrated a reduction in cell survival as a function of increasing dose, with a median lethal dose (LD50) of 3.171 Gy (95% CI: 2.837-3.525 Gy) for irradiated PC3 cells and an LD50 of 4.947 Gy (95% CI: 3.824-6.071 Gy) for irradiated PC3 spheroids. The results also demonstrated a decrease in spheroid viability with increasing dose, with a significant reduction in viability observed only for doses above 8 Gy. It is noteworthy that even at the highest dose (10 Gy), the reduction in spheroid viability was 30%. Thus, considering the results obtained, PC3 spheroids (3D) demonstrated greater radioresistance than irradiated PC3 monolayer cells (2D).In conclusion, the irradiation system developed for in vitro cell irradiation proved to be an important tool with high translational value for conducting radiobiological studies, facilitating studies of X-ray radiation response in both traditional (2D) culture models and 3D cell cultures that better reproduce the characteristics of in vivo tumors.O cancro da próstata é um dos tipos de cancro mais incidentes e com a sexta maior taxa de mortalidade a nível mundial. As atuais opções terapêuticas para esta doença incluem a cirurgia, a quimioterapia, a terapia hormonal e a radioterapia de fonte externa (EBRT). A radioterapia é um dos tipos de tratamento mais utilizados em oncologia, e envolve a irradiação do local do tumor, com radiação ionizante, de forma a induzir um efeito anti-tumoral através da formação de quebras de cadeia simples e/ou duplas no DNA. Apesar dos avanços nas modalidades e nos equipamentos utilizados na radioterapia de fonte externa com raios-X, ainda existem lacunas no conhecimento dos efeitos biológicos associados aos tratamentos deste tipo de radioterapia, que podem ser utilizados para um planeamento e tratamento mais personalizado. Na radiobiologia, as curvas de sobrevivência obtidas através de ensaios clonogénicos em culturas bidimensionais (2D) são o principal método para determinar a resposta à radiação. No entanto, estes modelos não replicam a arquitetura tumoral típica. Para colmatar esta lacuna, os modelos celulares de esferoides (3D) têm ganho popularidade, pois representam com uma maior precisão a arquitetura tumoral dinâmica. Para além disso, existe a necessidade de realizar estudos em sistemas de irradiação que representem as condições clínicas, de modo a potenciar a translação clínica dos resultados obtidos. Desta maneira, o principal objetivo desta dissertação foi desenvolver um sistema de irradiação eficaz de modelos celulares pré-clínicos, com elevada translação clínica, que permitisse a irradiação de células de cancro da próstata, em culturas tanto 2D como 3D. O objetivo secundário foi a otimização do protocolo de irradiação que garanta condições de posicionamento e de acondicionamento reprodutíveis, de modo a estudar os mecanismos subjacentes à resposta por parte das células à radioterapia de fonte externa.Primeiramente, procedeu-se ao desenvolvimento de um fantoma composto por um material com densidade semelhante à da água (resina epóxi), com dimensões 30×30 cm e com 5 cm de espessura. Este fantoma era composto por duas peças; uma exterior, responsável por preencher o espaço circundante das placas de cultura, e uma interior, responsável por preencher as bolsas de ar que se encontram na parte inferior das placas de cultura. De seguida, procedeu-se ao desenvolvimento de um plano de radioterapia, começando pela obtenção de imagens CT (do inglês, computed tomography) do fantoma, seguido da obtenção e otimização de planeamentos de IMRT (do inglês intensity modulated radiation therapy) que abrangessem as doses de 0,25 Gy, 0,50 Gy, 0,75 Gy, 1 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 5 Gy, 6 Gy, 8 Gy e 10 Gy, para cada placas de cultura de 6 poços e de 96 poços. Por fim, procedeu-se à irradiação das células PC3, tanto em cultura 2D como em cultura 3D. Para validação do método de irradiação desenvolvido, foram avaliados os efeitos biológicos induzidos pela exposição a raios-X nestas culturas celulares. Para isso, foi avaliada a sobrevivência celular, 8 dias após a irradiação das células em cultura 2D e em cultura 3D (esferoides), através do ensaio clonogénico, que permite a avaliação da capacidade das células em formar colónias e sobreviver a longo prazo. Além disso, foi avaliada a viabilidade celular dos esferoides (3D), 7 dias após a sua irradiação, através do ensaio de CellTiter-Glo® que quantifica os níveis de ATP intracelualr. Os resultados demonstraram uma redução da sobrevivência celular em função do aumento da dose, tendo sido determinada uma dose letal média (DL50) de 3,171 Gy (IC95%: 2,837-3,525 Gy) para as células PC3 irradiadas e uma DL_50 de 4,947 Gy; IC95%: 3,824-6,071 Gy) para os esferoides PC3 irradiados. Os resultados também demonstraram uma diminuição da viabilidade dos esferoides com o aumento da dose, sendo verificada uma diminuição significativa da viabilidade apenas para doses superiores a 8 Gy. Importa salientar que, mesmo para a dose mais elevada (10 Gy), a redução da viabilidade dos esferoides foi de 30%. Assim, tendo em conta os resultados obtidos, os esferoides PC3 (3D) demonstraram uma maior radiorresistência do que as células PC3 irradiadas em monocamada (2D).Concluindo, o sistema de irradiação desenvolvido para a irradiação de células in vitro demonstrou ser uma ferramenta importante e de elevado valor translacional para a condução de estudos de radiobiologia, facilitando a realização de estudos de resposta à radiação por raios-X, tanto em modelos de cultura tradicionais (2D), como em culturas celulares 3D que melhor reproduzem as caraterísticas do tumor in vivo.FCTFCTFCT2024-09-27info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesishttps://hdl.handle.net/10316/118008https://hdl.handle.net/10316/118008TID:203826884porFranco, Pedro Daniel Ferreirainfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2025-01-23T00:05:55Zoai:estudogeral.uc.pt:10316/118008Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T06:11:53.371160Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse
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