Molecular detection of the botanical origin of pollen in honey bee-collected pellets: a comparison of methods
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| Publication Date: | 2018 |
| Format: | Master thesis |
| Language: | eng |
| Source: | Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) |
| Download full: | http://hdl.handle.net/10198/19828 |
Summary: | Dupla diplomação com a Université Libre de Tunis |
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Molecular detection of the botanical origin of pollen in honey bee-collected pellets: a comparison of methodsPollen identificationDNA extractionStorage methodsITS2DNA metabarcodingHTSDomínio/Área Científica::Ciências Agrárias::Biotecnologia Agrária e AlimentarDupla diplomação com a Université Libre de TunisIdentification of botanical origin of mixed pollen samples has several applications, including assessment of plant-pollinator interactions, botanical origin of honey, monitoring of pesticide use, monitoring of allergy-related airborne pollen sources, among others. Such applications, however, have previously been limited to conventional pollen identification via light microscopy, which usually has low taxonomic resolution and requires expert knowledge. One alternative for botanical identification of mixed pollen samples is to use of DNA metabarcoding high throughput sequencing (HTS), which could overcome these drawbacks. Recent studies demonstrate that the nuclear barcoding marker ITS2 (internal transcribed spacer 2 region of nuclear ribosomal DNA) can be amplified from DNA extracted from mixed pollen samples. The aim of this study was to compare a variety of methods of storage/transportation and DNA extraction that ensure good DNA yield and quality appropriate for botanical identification of mixed pollen samples by means of a DNA metabarcoding approach, combining the amplification of ITS2 with HTS. In the context of the international project “INSIGNIA: environmental monitoring of pesticide use through honeybees”, mixed pollen samples were collected from traps set up in apiaries from several European countries, stored by beekeepers and later transported to the laboratory of CIMO for identification of plant taxa and inference of relative abundances. Four methods of genomic DNA isolation (NucleoSpin Food kit, GF-1 Plant kit, HigherPuritykit, and CTAB- PVP) were compared regarding DNA yield and purity by means of spectrophotometry and standard gel electrophoresis. Additionally, four storage/transportation methods of trap- collected pollen samples (freezing at -20 °C, drying at 25°C for 2 days, drying with silica, and placing in ethanol) were compared to assess their impact on the quality and quantity of extracted DNA. The results demonstrated the superior efficacy of the NucleoSpin DNA extraction method. The different storage/transportation conditions of pollen samples were compared for their impact on DNA quality and quantity using the NucleoSpin as the DNA extraction method. The results showed that the DNA extracted from the pollen samples placed in ethanol had the best quality/yield compared to the DNA extracted from the other samples with different storage conditions. Two primer pairs targeting ITS2 region ITS- S2F/ITS4R and ITS-u3/ITS-u4, were employed to identify plant taxa via metabarcoding HTS. The number of taxa identified in common using these two primers were 48 families, 118 genera, and 204 species, corresponding to 87.2 % , 79.5%, and 68.7%, respectively.The results of identification of taxa we present very similar results, making comparisons difficult, with a slight difference in the number of taxa (ITS-u3/ITS-u4 with higher number of identified taxa) and the abundance (ITS-S2F/ITS4R with higher abundance of taxa identified). This study thus offers improvements in the laboratory workflow ensuring a good DNA quantity and quality for downstream HTS applications.A identificação da origem botânica de amostras de pólen tem várias aplicações, incluindo avaliação das interações planta-polinizador, origem botânica do mel, monitorização do uso de pesticidas, monitorização de fontes de pólen do ar causadoras de alergias, entre outras. Tais aplicações, no entanto, têm sido limitadas pela identificação convencional de pólen por microscopia óptica, que geralmente possui baixa resolução taxonómica e requer conhecimento especializado. Uma alternativa para a identificação botânica de amostras mistas de pólen é o uso de “DNA metabarcoding high throughput sequencing (HTS)”, que pode superar essas desvantagens. Estudos recentes mostram que o código de barras nuclear ITS2 (região espaçadora interna transcrita 2 do DNA ribossómico nuclear) pode ser amplificado a partir de DNA extraído de amostras mistas de pólen. O objetivo deste estudo foi comparar uma variedade de métodos de armazenamento/transporte e extração de DNA que garantam um bom rendimento e qualidade do DNA adequados para a identificação botânica de amostras de pólen misto por meio de uma abordagem de DNA metabarcoding, combinando a amplificação de ITS2 com HTS. No contexto do projeto internacional “INSIGNIA: monitorização ambiental do uso de pesticidas através das abelhas”, foram colhidas amostras de pólen a partir de capta polens montados em apiários em vários países da Europa, armazenadas pelos apicultores e posteriormente foram transportadas para o laboratório do CIMO para identificação botânica e inferência das abundâncias relativas. Quatro métodos de isolamento de DNA genómico (NucleoSpin Food kit, GF-1 Plant kit, HigherPuritykit e CTAB-PVP) foram comparados quanto ao rendimento e pureza do DNA por meio de espectrofotometria e eletroforese em gel de agarose. Adicionalmente, quatro métodos de armazenamento/transporte de amostras de pólen (congelamento a -20 ° C, secagem a 25 ° C por 2 dias, secagem com sílica e colocação em etanol) foram comparados para avaliar o seu impacto na qualidade e quantidade do DNA extraído. Os resultados demonstraram a superioridade do método de extração de DNA NucleoSpin. As diferentes condições de armazenamento/transporte das amostras de pólen foram comparadas quanto ao seu impacto na qualidade e quantidade do DNA, usando o NucleoSpin como método de extração de DNA. Os resultados mostraram que o DNA extraído das amostras de pólen colocadas em etanol apresentou a melhor relação qualidade/rendimento comparado com o DNA extraído das outras amostras submetidas a diferentes condições de armazenamento. Dois pares de primers da região ITS2, ITS- S2F/ITS4R e ITS-u3/ITS-u4, foram utilizados para identificar os taxa representados nas amostras de pólen através do método DNA metabarcoding HTS. O número de taxa identificados em comum usando estes dois pares de primers foi de 48 famílias, 118 géneros e 204 espécies, correspondendo a 87,2%, 79,5% e 68,7%, respectivamente. A análise dos resultados sugere que os dois pares de primers são muito semelhantes, com uma pequena diferença no número de taxa (ITS-u3/ITS-u4 com maior número de taxa identificados) e na abundância (ITS-S2F/ITS4R com maior abundância de taxa identificados). Este estudo contribuiu para a melhoria do fluxo de trabalho laboratorial garantindo uma boa quantidade e qualidade do DNA com vista a aplicações HST a jusante.This work was developed in the framework of the international project “INSIGNIA: environmental monitoring of pesticide use through honeybees”, supported by the Health and Food Safety Directorate General; SANTE/E4/SI2.788418-SI2.788452-INSIGNIAPinto, M. AliceAmaral, Joana S.Hamda, Cherif BenBiblioteca Digital do IPBHaba, Eya2019-11-21T10:19:25Z201920182019-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10198/19828TID:202311252enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2025-02-25T12:10:13Zoai:bibliotecadigital.ipb.pt:10198/19828Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-28T11:37:08.002893Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse |
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